3.2.2 PCR实验流程在线视频

同学们好

今天我给大家介绍的这个知识点是

PCR实验流程

首先介绍PCR模板

几乎所有形式的DNA和RNA

都是PCR反应的合适底物

我们可以看到基因组DNA 质粒DNA

噬菌体DNA 预先扩增的DNA

cDNA和mRNA都可以作为底物

扩增靶序列长度一般在500 bp以内

以100～300 bp为佳

扩增较长的PCR片段时

模板的质量最为重要

所以我们在抽提纯化DNA时

应最大限度避免损伤

尽可能减少反复吹打

选用大孔径吸头避免对DNA的随机剪切

PCR缓冲液一般是随Taq DNA聚合酶供应

标准缓冲液一般包括50 mM KCl

10 mM的Tris-HCl（pH8.3 室温）

1.5 mM的MgCl2

Mg2+浓度非常重要

浓度对反应特异性和产量有影响

一般是1.5-2 mM（终浓度）

浓度过高特异性降低

浓度过低产物减少

样品含EDTA或其它螯合物时

可增加Mg2+的浓度

这样能够提高反应产物浓度

高浓度的DNA和dNTPs时

需要调节Mg2+浓度

三磷酸核苷酸（dNTPs）包含四种核苷酸

它溶于pH为7.0的NaOH贮存液

分装在-20℃冰箱保存

不要反复冻融

dNTPs使用浓度在20-200 μmol/L

4种dNTP等浓度配合以减少错配错误

高浓度dNTPs易产生错误掺入

过高不扩增

过低将降低反应产物的产量

dNTPs能与Mg2+结合

使游离的Mg2+浓度降低

引物（primer）

它是一小段单链的DNA或RNA

核酸合成反应时

作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点

而起作用的多核苷酸链

网络上我们有这个Primer3（在线服务）

Primer 5.0（自动搜索）

Oligo6（引物评价）等引物设计软件可以应用

都是在线的

引物设计的原则

引物长度一般以15-30 bp为宜

一般（G+C）的含量在45-55%

Tm值高于55℃

最简便的计算方法是[Tm=4(G+C)+2(A+T)]

人工合成的寡聚核苷酸引物

需要经PAGE或离子交换HPLC进行纯化

引物一般用TE配成

储存在较高浓度的母液（约100 μM）中

保存于-20℃

使用时取出一部分用ddH2O

配制成10 μM或20 μM的工作液

引物的3’端不应与引物内部有互补

避免内部形成二级结构

两个引物在3’端不应出现同源性

以免形成引物二聚体

引物浓度不宜偏高

过高有两个弊端

一个是容易形成引物二聚体（primer-dimer）

二是当扩增微量靶序列

并且起始材料又比较多时

容易产生非特异性扩增

DNA聚合酶的选择

首先我们看看Taq

Taq扩增效率最高

扩增6 kb以下的片段

出错率为10-5

Hotstart Taq酶

它是经过化学修饰的耐热DNA聚合酶

常温下活性被化学基团封闭

94℃-95℃加热时才能恢复正常活力

避免起始循环在低温度下的

非特异性扩增

提高灵敏度和特异性

Taq Plus扩增效率比Pfu高

保真性比Taq好

扩增10 kb以下片段

Pfu保真性最高

出错率为10-6

扩增2 kb以下的片段

Taq Platinum热启动时

高保真耐热DNA聚合酶

对保真度要求很高

而用Pfu扩增有难度时

一般选择Taq Platinum

一般扩增长度可达4 kb

Long Taq具有3’-5’外切酶活性的

耐热DNA聚合酶

扩增效率高且错配率低

简单模板扩增可达40 kb

复杂模板扩增可达15 kb

不同实验对酶的选择

克隆普通长度的目的DNA片段

使用Taq、Taq Plus

保真度要求较高

片段比较短

如点突变、基因筛选等

用Pfu、Taq Platinum

高保真长片段扩增

如构建基因图谱及分子遗传学研究

一般用Long Taq和Taq Plus

扩增基因组模板

需要降低背景时

我们往往选用Hotstart Taq、Taq Platinum

实时荧光定量PCR反应一般选用

Taq、Hotstart Taq、Taq Platinum

从菌株或质粒模板

筛选鉴定目的克隆

扩增6 kb以下的片段用

Taq、Taq Plus、2×Taq PCR MasterMix

模板比较复杂或者目的片段丰度低

用普通Taq酶扩增不出条带我们可以用

2×Taq PCR MasterMix、2×Pfu PCR MasterMix

PCR参数循环

预变性是模板DNA完全变性

与PCR酶完全激活对PCR

能否成功扩增至关重要

建议加热时间参考试剂说明书

一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟

循环中变性的参数

一般95℃

30秒足以使各种靶序列完全变性

时间过长会损害酶的活性

过短靶序列变性不彻底

容易造成扩增失败

引物退火

退火温度

一般根据引物的Tm值

比Tm值低5℃左右

然后在此实验基础上进行预估

引物的延伸

一般在72℃进行

这是Taq酶最适温度

时间随扩增片段的长短而定

推荐1 kb以上时含Pfu

及其衍生物设定为1 min/kb

循环数

大多数PCR是25-40循环

过多会产生非特异扩增

延伸

最后一个循环后

反应在72℃维持5-15分钟

使引物延伸完全

并使单链产物退火成双链

PCR产物的检测

可以应用琼脂糖凝胶电泳

它简便易行

常使用

但是它一般要用一种致癌物EB染色

另外一种是聚丙烯酰胺凝胶电泳

它的灵敏度高

但是操作相对复杂

PCR反应注意事项

特别注意防止DNA污染的发生

样品间相互污染可产生假阳性结果

公用的、没有密码保护的PCR仪

我们需要常常检查PCR程序是否正确

就是现在PCR仪里面内设了许多程序

你如果调用程序的时候

也要看别人是不是修改了参数

不使用过量的试剂

使用过量试剂会造成

非特异性产物的增加

试剂购回后应分小份保存使用

加完所有试剂后应用移液器枪头吹打几次

以保充分混匀

使用阴性对照可检测污染发生

使用阳性对照有助于良好扩增样本

电泳时使用DNA分子量标准品判断

PCR失败以及防止条带跑出凝胶

扩增较长、GC含量高的模板

或易于产生二级结构的

模板适量使用添加剂

如DMSO等

或者针对长模板、GC含量高的Taq酶

最好电泳产物当天检测

大于48 h后条带不规则甚至消失

这个知识点就介绍到这里

谢谢大家！