3.4.2 蛋白质印迹实验流程在线视频

同学们好

今天我介绍的这个知识点是

蛋白质印迹实验流程

实验流程包括1. 样品准备

2. 电泳

3. 转膜

4. 封闭

5. 一抗孵育

6. 二抗孵育

7. 显影

首先我们介绍样品准备（Sample preparation）

准备的试剂包括裂解缓冲液

蛋白酶或磷酸酶抑制剂

蛋白定量试剂

上样前样品准备还包括蛋白变性等

样品的类型有全细胞 细胞质可溶蛋白

细胞骨架蛋白 细胞膜蛋白

细胞核蛋白 线粒体蛋白等种类

根据样品类型的不同

抽提液(Lysis buffer)的选择也不一样

蛋白酶抑制剂（Protease inhibitors）的选择

也根据实验所需要采用不同的

蛋白酶抑制剂

蛋白定量（Determination of protein concentration）有多种方法

有考马斯亮蓝法（Bradford assay）

Folin-酚试剂法（Lowry assay）

二喹啉甲酸法（Bicinchoninic acid (BCA) assay）

和紫外吸收法（A280）

考马斯亮蓝法（Bradford assay）

是考马斯亮蓝G-250与蛋白结合形成蓝色化合物

在595 nm处有最大吸收值

化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比

优点是操作简便迅速

消耗样品量少

经济

缺点是高浓度的Tris EDTA

甘油和去污剂对测定有一定的干扰

蛋白定量喹啉甲酸法（Bicinchoninic acid assay）

就是BCA法

碱性条件下

蛋白质分子中的肽键能与Cu2+生成络合物

同时将Cu2+还原成Cu+

并与二喹啉甲酸钠盐结合形成稳定的

蓝紫色复合物

该化合物在562 nm处有高的吸光值

并且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比

据此可测定蛋白质浓度

它具有操作简单

复合物稳定

灵敏性高

不受去垢剂影响

但缺点是较昂贵的费用

但是目前我们做实验

一般用这种方法用的也比较多

上样前准备（Preparation of samples for loading into gels）

上样量一般是50-100 μg

上样缓冲液

95℃变性

5-10 min

电泳

电场作用下

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中

迁移速度与其分子大小

构型和所带的电荷有关

十二烷基硫酸钠（SDS）能与蛋白结合

改变蛋白原有构象电荷数

使不同蛋白具有相同的构象和电荷

只存在分子量之间的差异

因此

SDS-PAGE胶中蛋白质依分子量大小分开

这个表中我们可以看到蛋白质不同分子量

使用的凝胶浓度也不一样

这是一个SDS-PAGE凝胶配制配方

同时有已经做好的成品灌装胶

电泳注意事项

在配制PAGE胶时

注意胶内不要有气泡

电源正负极不能接反

电泳缓冲液要新鲜配制

转膜(Transfer)是将电泳后分离的蛋白质

从凝胶中转移到

固相载体（例如NC膜或PVDF膜）上的过程

常用的转移方法有湿转和半干转

湿转操作容易

转移效率高

半干转适合用于大胶的蛋白转移

所用缓冲液少

转膜的步骤（以槽式湿转为例）

是将胶浸于转移缓冲液中平衡5 min

依据胶的大小剪取膜和滤纸6片

放入转移缓冲液中平衡5 min

如用PVDF膜需用甲醇浸泡3-5秒

装配转移三明治

海绵 3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-海绵

每层放好后

赶去气泡

将转移槽置于冰浴中

放入三明治（膜的那一面对正极）

加转移缓冲液

插上电极

100 V

1.5 h（电流约为0.3 A）

转膜注意事项

海绵-滤纸-膜-胶-滤纸-海绵之间不能有气泡

正负极不能接反

摸索最佳转膜时间

冰浴中进行

封闭(Blocking)只是对PVDF膜上

未结合蛋白的部位进行封闭

对已结合蛋白的部位不会有任何影响

正常的封闭可降低非特异性结合

常用的封闭液为5%的脱脂奶粉或BSA

一抗孵育（Primary antibody incubation）

一抗的选择

一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过

适用于何种分析类型

如可用于WB IHC ICC ELISA FCM分析等

尽量选择适用类型的抗体

一般抗体说明书都列出该抗体经验证过

适用于何种动物或人的标本

如 可以用于rat mouse human goat等等

应选择物种相同或有交叉反应的抗体

抗体由不同免疫原免疫宿主制备得来

免疫原包括

全长蛋白 蛋白片段 多肽等

抗体说明书一般都有免疫原的描述

如果打算检测的是蛋白片段

或蛋白全长的某一区域

则必须选择含此片段域的

免疫原制备出的抗体

偶联二抗结合无偶联物的一抗时

一抗宿主动物的物种选择较为重要

对于WB而言

尽可能选择与样本不同种系物种的一抗

从而避免二抗

与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应

例如 检测小鼠样本蛋白

则不应选择小鼠或大鼠源的一抗

最好选择兔源一抗

一抗的浓度和孵育条件也是要注意的

二抗（Second antibody incubation）的选择

二抗必须是抗一抗来源物种的抗体

对于单克隆抗体

二抗需与一抗的类别或亚类别相匹配

如果一抗是小鼠IgM

二抗就应是抗小鼠IgM

耦联到二抗上的探针主要有

酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP等）

荧光基团（FITC RRX TR PE等）和生物素

选用哪种探针标记的二抗取决于具体的实验

对Western blot而言最常用的二抗

是酶标二抗和荧光基团标记的二抗

我们要注意一抗的宿主

二抗稀释的浓度

二抗的稀释液不能含叠氮钠(HRP)

Western Blot显色方法主要有放射自显影

底物DAB显色

底物化学发光ECL 底物荧光ECF

放射自显影是利用放射性核素发射的射线

使感光材料中的卤化银等感光

实现放射性标记的定位和定量的检测

灵敏度高 分辨率好 保存时间长久

实验所用的放射性物质对人体有辐射作用

底物DAB显色

利用3,3-二氨基联苯胺（DAB）可和

辣根过氧化物酶（HRP）作用形成褐色不溶产物

对目标蛋白显色

操作简单

灵敏度低

现配现用

有较强的毒性

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是

辣根过氧化物酶在H2O2存在下

氧化化学发光物质鲁米诺并发光

大部分Western blot显色底物是化学发光

灵敏度高

需要曝光检测设备或凝胶成像设备

底物荧光（ECF）法是利用标记不同

荧光染料（如Cy2 Cy3 Cy5）的二抗

分别对对应相应的目的蛋白

通过检测荧光染料的信号强度

实现蛋白信号的检测

以进行精确的定量分析

允许在同一张转印膜上用不同颜色的

荧光底物同时检测不同的目标

间接实现一次实验可检测多种蛋白

这个知识点就介绍到这里

谢谢大家！