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2.3.5 DNA重组技术在线视频

2.3.5 DNA重组技术

下一节:2.3.6 基因工程技术的应用

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2.3.5 DNA重组技术课程教案、知识点、字幕

分子生物学为生物技术的发展

提供了强有力的工具

使得近十几年来

或者几十年来

整个生物学的各个领域

实际上都发生了翻天覆地的变化

比如最近十几年

得到了迅猛发展的DNA测序技术

使得我们从一开始

对自己细胞内的DNA知之甚少

到现在的

各种各样的基因组信息

又比如说

近两年发展出来的

基因组编辑技术

有希望能够改变人类的各种

遗传疾病

分子生物学的出现

基于技术的发展

而分子生物学

各种技术的发展

它又为其他

生命科学方向

提供了进一步的技术支持

在接下来的部分

我们将讲述一下

分子生物学中的

各种不同的技术

及其应用

首先

在分子生物学的各项技术中

最为基本

也是最为重要的

是DNA重组技术的发展与应用

DNA重组技术

其实我们可能都听过

它实际上有很多很多不同的名字

人们也把它叫做基因工程

遗传工程

或者叫 genetic engineering

或者也叫基因克隆

Gene Cloning

或者分子克隆

Molecular Cloning

那么我们看看

DNA重组技术

它包含什么样的步骤呢

DNA重组技术

主要包括以下6个不同的步骤

第一目的基因的获取

第二克隆载体的选择与构建

第三外源基因与载体的连接

第四重组DNA转化进入到了宿主细菌

第五筛选正确的重组体

第六目的基因的表达

接下来我们将分别给大家介绍一下整个步骤中的

各个步骤它是怎么样发生的怎么样去操作的

第一目的基因的获取

实际上存在几种不同的方式

在分子生物学的早期

人们主要是通过对

生物体内基因组DNA的提取

或者cDNA的制备

来获取所需要的目的基因

因为无论是基因组DNA也好

cDNA也好

都是要从大量的其他DNA中

选取获得所需要的目的基因

所以能得到的目的基因数目是有限的

其过程也是非常的繁琐

它需要大量的人力物力

以及非常长的周期

随后

人们发展了

DNA的化学合办法

可以合成相对较为简单的

短链基因

往往在100个碱基以下

而只有当PCR也就是说

聚合酶链式反应

真正的被发明发展起来以后

人们才真正有能力在很短的时间内

获得大量的目的基因

DNA重组技术的第二步

是克隆载体的选择与构建

所谓的载体就是指

能够将外源的DNA片段送入

到宿主细胞内进行克隆

或表达的一个运载工具

根据实验的目的不同

载体可以分为两大类

第一类叫克隆载体

第二类叫表达载体

顾名思义

克隆载体

实际上就是为了实现

外源DNA片段在宿主菌中的克隆

从而获得大量的目的基因

表达载体

不仅仅需要克隆

还需要将所克隆的

目的基因能够得以表达

从而在这个载体上它需要更多的其他DNA元件

比如说

帮助这个基因进行表达的启动子等等

我们常见的克隆载体

包括有质粒

噬菌体 病毒等

其中质粒是我们接触最多的

质粒也就是plasmid

是一种在细菌中

可以独立存在于染色体之外

能够自主复制的

小型双链环状的DNA分子

质粒上

包括了满足克隆要求的

各种DNA元件

比如具有

一个质粒的复制的起始点

帮助质粒的复制

包括易于筛选的

选择性标记

独立抗性基因

多种限制性内切酶的

单一识别位点

较小的分子量

以及不同的拷贝数目

还有最后一点

是比较高的一个生物安全性

图中所示的

是一种在实验室中较为常用的

质粒载体叫pUC18

或者叫pUC18

这个载体它在进入宿主细胞以后

可以形成约500个拷贝

在每一个细胞里

它具有一个多克隆位点

其中包含了各种常用的

限制性内切酶的识别序列

pUC18中

还有一个lacZ基因

也就是我们前面所学的

乳糖操纵子中的一个结构基因

而多克隆位点

正好是位于这个lacZ基因中间

所以你可以想象

当一个外的源基因被插入

放置到这个多克隆位点后

它们的插入

将会打断这个lacZ基因

从而使得该基因没有办法进行正常表达

而LacZ基因

是实际上可以催化的

一种化学物质我们实验室里面常有的

叫X-gal的剪切

而剪切以后的X-gal

实际上会变成一种蓝色的物质

所以从而你可以看到

当一个lacZ基因

被外源DNA片段打断了

那么在含有X-gal的培养基中

这些菌它将无法切割X-gal

从而使得你可以看到一个白色菌落

所以这个lacZ的存在

可以使得我们快速的筛选

获得外源DNA的克隆

从而极大的提高了克隆的效率

此外 在pUC18上面还带有

氨卞青霉素的抗性基因

使得带有这个质粒的菌

可以在带有氨卞青霉素的培养基中生长

从而便于你对这个质粒的筛选

DNA重组技术的第三步

是外源基因与载体的连接

需要对目的基因以及载体

他要进行适当的一个切割过程

在生物体内有很多种DNA酶

包括外切酶

也就是从DNA的

一个末端往DNA链内部切割的这些酶

以及内切酶

也就是说可以识别DNA的链

然后在中间发生切割

而其中在DNA重组技术中得以

大量使用的

是具有位置特异性的

限制性核酸内切核酸酶

这一类酶的特点是说

它们可以在特定的位点

对DNA造成切割

水解这个DNA分子骨架上的磷酸二酯键

它们可以识别

特异的一段DNA序列

比如说有一种酶叫EcoRI或者叫

它的识别的位点是GAATTC

这样的一个双链DNA序列

它们可以识别这个序列

然后在这个序列上造成一个切割

从而使得这2段DNA被分别开

大多数常见的限制性内切酶

都识别大概4-6个不同的碱基对

也有很长的到十几个的

限制性内切酶的切割

是根据DNA断裂后的状态

可分成两种

一种是切割后断裂处

DNA单链上它的碱基数目是一样的

所以当它们这两个单链互补配对的时候

它们最后形成的是一个平的末端

所以这些叫做平末端限制性内切酶

也叫blunt end限制性内切酶

而另外一种

它切割的时候不是正好在它

互补配对的两个碱基之间切

而是一条切在这个地方

另外的一条可能在一个相对远的地方

最后形成了一条链上

的碱基多一点另外一条链上的碱基

少一点

所以这类的酶

产生的末端我们把它叫做

粘性末端或者sticky end

sticky end也就是说

它切割后的DNA双链上

有一条链上会多几个碱基

另外一条链会少几个碱基

而根据多出来的这几个碱基

位于DNA链的5’端还是3’端

我们可以把它叫做5’突出或者3’突出

在DNA重组过程中

一般都会利用限制性内切酶

使得目的基因和你的载体

分别切割

生成了相互配对的或者适配的DNA末端

然后利用另一种

我们的DNA重组技术中常用的

另外一种酶也就是

DNA连接酶 ligase

它们可以把它们这些

靠近在一起的这两个末端

中间没有这个磷酸二酯键的

重新连接起来

形成最后的这个重组DNA

DNA连接酶

是一种能够催化

DNA中相邻的3’ 羟基

和5’磷酸基

末端之间形成磷酸二酯键

并把两段DNA

拼接起来的这个核酸酶

连接酶功能的发挥也同样

需要ATP来提供能量

DNA重组技术的第四步

是将重组完以后获得的DNA

转化进入到宿主的细菌里面去

常用的宿主菌在实验室

用的是大肠杆菌 E.coli

它原因是因为它们生长的很快

操作起来很方便

培养起来也很简单

DNA不能像很多小分子一样

可以随意的通过渗透

通过细胞膜而进入到细菌体内

所以需要特定的方法

去帮助这个DNA进入细菌

常用的方法

我们分为化学法和电击法

它们的基本原理都是

非常相似的

要不就是利用化学物质

要不就是利用高压的电击

使得细菌的细胞膜发生

短时间的损伤

产生了大的孔

从而使得DNA可以通过

DNA重组技术的第五步

是如何去筛选正确的重组体

大家可以想象

在连接反应结束后

的这个体系中

除了正确连接的重组子之外

还包括其他的DNA 对吧

比如说不带有目的基因的载体

自己连起来了

以及目的基因它们自己也许也会连起来

当所有的这些DNA进入到细菌以后

为了获得一个正确的重组体

我们需要进行一个特定的筛选

我们前面介绍了在puc19

或者18它们的载体上代有了抗生素基因

所以我们可以利用这个抗生素基因

把转化后的细菌

放置到一个带有

特定抗生素如氨苄青霉素的培养基上

这样只有带有质粒的菌才可以生长

而质粒中可以带有

或者不带有你所需要插入的这个目的片段

那么接下来

可以利用比如说我们前面的

pUC18质粒中的特性

如利用外源DNA的插入可以导致

lacZ基因的失活而最终

使得细菌菌斑呈现白色

所以我们可以挑取白色的

克隆进行下一步的确认

最终可以确信

我们得到的质粒

中间是包含了我们所需要的目的序列

DNA重组技术的最后一步

是目的基因的表达

获取所需要的蛋白质

进行后续的科学研究

当然如果克隆的目的只是为了

大量的获得一个基因

那么这一步实际上是没有必要的

普通生物学课程列表:

绪论——走进生命科学

-绪论

--绪论

-人物访谈——走进精准医学

--第一节 什么是精准医学

--第二节 精准医学用于临床应具备哪些条件

--第三节 精准医学的临床应用实例

--第四节 给医学生的建议

--第五节 精准医学的发展展望

第一章 细胞生物学基础

-第一节 细胞概述

--1.1.1 细胞的基本特征

--1.1.2 原核生物与真核生物的区别

-第一章 细胞生物学基础--第一节 细胞概述

-第二节 细胞膜与物质的跨膜运输

--1.2.1 质膜的结构与基本成分

--1.2.2 质膜的基本特征及功能

--1.2.3 膜转运蛋白

--1.2.4 小分子物质的跨膜运输

--1.2.5 细胞连接

-第一章 细胞生物学基础--第二节 细胞膜与物质的跨膜运输

-第三节 真核细胞的结构

--1.3.1 线粒体和叶绿体

--1.3.2 细胞的内膜系统

--1.3.3 过氧化物酶体

--1.3.4 细胞骨架——微丝

--1.3.5 细胞骨架——微管

--1.3.6 细胞骨架——中间丝

--1.3.7 马达蛋白

--1.3.8 细胞核与染色质

--1.3.9 核糖体

-第一章 细胞生物学基础--第三节 真核细胞的结构

-第四节 细胞的能量代谢

--1.4.1 能量货币ATP

--1.4.2 细胞是如何获得能量的

--1.4.3 糖酵解与柠檬酸循环

--1.4.4 电子传递与氧化磷酸化

--1.4.5 乙醇发酵与乳酸发酵

--1.4.6 营养物质的分解与代谢

--1.4.7 叶绿体与光系统

--1.4.8 光反应

--1.4.9 固碳反应

--1.4.10 C4途径与CAM途径

-第一章 细胞生物学基础--第四节 细胞的能量代谢

-第五节 细胞的分裂与分化

--1.5.1 细胞周期概述

--1.5.2 细胞周期调控的分子机制

--1.5.3 有丝分裂

--1.5.4 减数分裂

--1.5.5细胞分化与细胞全能性

--1.5.6细胞死亡

-第一章 细胞生物学基础--第五节 细胞的分裂与分化

第二章 分子生物学基础

-第一节 遗传的分子基础

--2.1.1 DNA的发现历史

--2.1.2 DNA的结构

--2.1.3 DNA的复制

--2.1.4 端粒及端粒酶

--2.1.5 蛋白质是表型的分子基础

--2.1.6 RNA的分子构成与功能

--2.1.7 DNA的转录

--2.1.8 遗传密码的破解

--2.1.9 遗传信息的翻译

--2.1.10 中心法则

--2.1.11 基因的突变

-第二章 分子生物学基础--第一节 遗传的分子基础

-第二节 基因的表达调控

--2.2.1 原核生物的基因表达调控

--2.2.2 真核生物的基因表达调控

--2.2.3 染色质的结构影响基因的转录

--2.2.4 蛋白质的组装调控基因的转录

--2.2..5 RNA转录后的加工

-第二章 分子生物学基础--第二节 基因的表达调控

-第三节 生物技术及其应用

--2.3.1 核酸的分子杂交

--2.3.2 DNA芯片技术

--2.3.3 聚合酶链式反应

--2.3.4 DNA凝胶电泳

--2.3.5 DNA重组技术

--2.3.6 基因工程技术的应用

-第二章 分子生物学基础--第三节 生物技术及其应用

-第四节 人类基因组及其遗传疾病

--2.4.1 DNA测序技术

--2.4.2 第三代DNA测序技术

--2.4.3 人类基因组及其应用

--2.4.4 人类的遗传性疾病

--2.4.5 癌基因与恶性肿瘤

-第二章 分子生物学基础--第四节 人类基因组及其遗传疾病

第三章 高等植物体的结构与功能

-第一节 高等植物体的细胞与组织

--3.1.1 初生壁

--3.1.2 次生壁

--3.1.3 与细胞壁相关的结构

--3.1.4 质体与液泡

--3.1.5 组织与组织系统

--3.1.6 分生组织

--3.1.7 表皮与周皮

--3.1.8 维管组织

--3.1.9 基本组织系统

-第三章第一节 高等植物体的细胞与组织

-第二节 植物的生长

--3.2.1 种子的萌发与幼苗的生长

--3.2.2 根的初生生长

--3.2.3 根的初生结构

--3.2.4 侧根的发生

--3.2.5 根的次生生长及其结构

--3.2.6 茎的初生生长及其结构

--3.2.7 茎的次生生长及其结构

--3.2.8 周皮与树皮

--3.2.9 年轮是如何产生的

--3.2.10 茎的初生组织与次生组织之间的关系

-第三章 高等植物体的结构与功能--第二节 植物的生长

-第三节 植物的生殖和发育

--3.3.1 植物的繁殖类型

--3.3.2 世代交替

--3.3.3 花的组成与基本结构

--3.3.4 花各部分结构的多样性

--3.3.5 花药的发育

--3.3.6 胚珠的发育

--3.3.7 开花与传粉

--3.3.8 花粉萌发和受精

--3.3.9 果实和种子的形成与传播方式

--3.3.10 被子植物生活史总结

-第三章 高等植物体的结构与功能--第三节 植物的生殖和发育

-第四节 植物的营养与运输

--3.4.1 植物叶片的结构

--3.4.2 气孔运动的调节

--3.4.3 植物的矿质营养

--3.4.4 根系是如何吸水的?

--3.4.5 水分在植物体内的运输

--3.4.6 矿质元素的运输

--3.4.7 有机物运输的经典实验

--3.4.8 有机物质的运输

--3.4.9 植物的营养适应-食虫植物

--3.4.10 植物的营养适应-氮元素的利用

--3.4.11 植物的营养适应-寄生植物

--3.4.12 植物的营养适应-菌根

-第三章 高等植物体的结构与功能--第四节 植物的营养与运输

-第五节 植物生长发育的调控

--3.5.1 植物激素概述

--3.5.2 生长素

--3.5.3 生长素的作用机制

--3.5.4 赤霉素

--3.5.5 细胞分裂素

--3.5.6 乙烯

--3.5.7 脱落酸

--3.5.8 激素间的相互作用

--3.5.9 光周期现象

--3.5.10 光敏色素

--3.5.11 植物对植食性动物和病菌的防御

-第三章 高等植物体的结构与功能--第五节 植物生长发育的调控

第四章 高等动物体的结构与功能

-第一节 动物的组织

--4.1.1 上皮组织

--4.1.2 疏松结缔组织

--4.1.3 致密结缔组织

--4.1.4 脂肪组织

--4.1.5 软骨

--4.1.6 硬骨

--4.1.7 血液

--4.1.8 结缔组织总结

--4.1.9 肌肉组织

--4.1.10 神经组织

--4.1.11 组织器官系统

-第一节 动物的组织--作业

-第二节 消化系统

--4.2.1 营养素及其消化和吸收

--4.2.2 人体消化系统的组成

--4.2.3 口腔和食管

--4.2.4 胃壁的结构

--4.2.5 胃的消化功能

--4.2.6 胃溃疡

--4.2.7 小肠的组织结构

--4.2.8 小肠消化液的组成及其功能

--4.2.9 营养物质的消化和吸收

--4.2.10 大肠的结构与功能

--4.2.11 肝脏和胰腺

--4.2.12 脊椎动物消化管的结构与功能适应

-第四章 高等动物体的结构与功能--第二节 消化系统

-第三节 呼吸系统

--4.3.1 呼吸系统的演化

--4.3.2 人的呼吸系统的结构与功能

--4.3.3 呼吸运动

--4.3.4 气体的交换

--4.3.5 氧气和二氧化碳的运输

--4.3.6 呼吸运动的调节

-第三节 呼吸系统--作业

-第四节 循环系统

--4.4.1 动物循环系统的演化

--4.4.2 血管的结构

--4.4.3 心脏的结构与血液循环

--4.4.4 心动周期

--4.4.5 心脏的传导系统

--4.4.6 动脉血压的形成

--4.4.7 输血与血型

--4.4.8 组织液的形成

--4.4.9 淋巴系

--4.4.10 常见心脑血管疾病

-第四章 高等动物体的结构与功能--第四节 循环系统

-第五节 内环境的控制

--4.5.1 动物排泄系统的演化

--4.5.2 内环境与稳态

--4.5.3 体温调节

--4.5.4 渗透调节与排泄

--4.5.5 人的泌尿系统的组成与功能

--4.5.6 原尿是如何生成的

--4.5.7 肾小管与集合管的重吸收

--4.5.8 肾小管与集合管的分泌作用

--4.5.9 尿液的浓缩

--4.5.10 尿液生成的总结

--4.5.11 肾脏对机体酸碱平衡的调节

--4.5.12 血压与血量的调节

--4.5.13 透过尿液分析检查疾病

-第四章 高等动物体的结构与功能--第五节 内环境的控制

-第六节 内分泌系统

--4.6.1 体液调节概述

--4.6.2 激素的作用机制

--4.6.3 内分泌系统与神经系统的联系

--4.6.4 激素分泌的调节

--4.6.5 神经垂体的内分泌功能

--4.6.6 腺垂体的内分泌功能

--4.6.7 生长激素的功能

--4.6.8 甲状腺调节代谢与发育

--4.6.9 甲状旁腺的功能

--4.6.10 胰岛素和胰高血糖素激素

--4.6.11 肾上腺皮质的内分泌功能

--4.6.12 肾上腺髓质的内分泌功能

-第四章 高等动物体的结构与功能--第六节 内分泌系统

-第七节 神经系统与神经调节

--4.7.1 静息电位

--4.7.2 动作电位

--4.7.3 神经冲动是如何传播的

--4.7.4 突触如何传递神经信号

--4.7.5 毒品为什么具有成瘾性

--4.7.6 反射与反射弧

--4.7.7 脑的结构与功能

--4.7.8 脊髓的结构与功能

--4.7.9 周围神经系统

--4.7.10 躯体运动神经与内脏神经的区别

--4.7.11 交感神经与副交感神经的作用

--4.7.12 中枢神经对内脏活动的调节

--4.7.13 神经系统的演化

-第四章 高等动物体的结构与功能--第七节 神经系统与神经调节

-第八节 生殖与胚胎发育

--4.8.1 精子的形态及发生

--4.8.2 卵子的发生

--4.8.3 卵子的发生受激素的调控

--4.8.4 生育的控制

--4.8.5 卵巢的周期性变化

--4.8.6 子宫的周期性变化

--4.8.7 海胆的受精过程

--4.8.8 哺乳动物的受精过程

--4.8.9 文昌鱼的胚胎发育

--4.8.10 两栖类的早期胚胎发育

--4.8.11 哺乳动物的胚胎发育

--4.8.12 羊膜是如何产生的

--4.8.13 人的胚胎发育

-第四章 高等动物体的结构与功能--第八节 生殖与胚胎发育

期中考试

-2020年秋季学期普通生物学期中考试

2.3.5 DNA重组技术笔记与讨论

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