当前课程知识点:普通生物学 > 第二章 分子生物学基础 > 第三节 生物技术及其应用 > 2.3.5 DNA重组技术
分子生物学为生物技术的发展
提供了强有力的工具
使得近十几年来
或者几十年来
整个生物学的各个领域
实际上都发生了翻天覆地的变化
比如最近十几年
得到了迅猛发展的DNA测序技术
使得我们从一开始
对自己细胞内的DNA知之甚少
到现在的
各种各样的基因组信息
又比如说
近两年发展出来的
基因组编辑技术
有希望能够改变人类的各种
遗传疾病
分子生物学的出现
基于技术的发展
而分子生物学
各种技术的发展
它又为其他
生命科学方向
提供了进一步的技术支持
在接下来的部分
我们将讲述一下
分子生物学中的
各种不同的技术
及其应用
首先
在分子生物学的各项技术中
最为基本
也是最为重要的
是DNA重组技术的发展与应用
DNA重组技术
其实我们可能都听过
它实际上有很多很多不同的名字
人们也把它叫做基因工程
遗传工程
或者叫 genetic engineering
或者也叫基因克隆
Gene Cloning
或者分子克隆
Molecular Cloning
那么我们看看
DNA重组技术
它包含什么样的步骤呢
DNA重组技术
主要包括以下6个不同的步骤
第一目的基因的获取
第二克隆载体的选择与构建
第三外源基因与载体的连接
第四重组DNA转化进入到了宿主细菌
第五筛选正确的重组体
第六目的基因的表达
接下来我们将分别给大家介绍一下整个步骤中的
各个步骤它是怎么样发生的怎么样去操作的
第一目的基因的获取
实际上存在几种不同的方式
在分子生物学的早期
人们主要是通过对
生物体内基因组DNA的提取
或者cDNA的制备
来获取所需要的目的基因
因为无论是基因组DNA也好
cDNA也好
都是要从大量的其他DNA中
选取获得所需要的目的基因
所以能得到的目的基因数目是有限的
其过程也是非常的繁琐
它需要大量的人力物力
以及非常长的周期
随后
人们发展了
DNA的化学合办法
可以合成相对较为简单的
短链基因
往往在100个碱基以下
而只有当PCR也就是说
聚合酶链式反应
真正的被发明发展起来以后
人们才真正有能力在很短的时间内
获得大量的目的基因
DNA重组技术的第二步
是克隆载体的选择与构建
所谓的载体就是指
能够将外源的DNA片段送入
到宿主细胞内进行克隆
或表达的一个运载工具
根据实验的目的不同
载体可以分为两大类
第一类叫克隆载体
第二类叫表达载体
顾名思义
克隆载体
实际上就是为了实现
外源DNA片段在宿主菌中的克隆
从而获得大量的目的基因
表达载体
不仅仅需要克隆
还需要将所克隆的
目的基因能够得以表达
从而在这个载体上它需要更多的其他DNA元件
比如说
帮助这个基因进行表达的启动子等等
我们常见的克隆载体
包括有质粒
噬菌体 病毒等
其中质粒是我们接触最多的
质粒也就是plasmid
是一种在细菌中
可以独立存在于染色体之外
能够自主复制的
小型双链环状的DNA分子
质粒上
包括了满足克隆要求的
各种DNA元件
比如具有
一个质粒的复制的起始点
帮助质粒的复制
包括易于筛选的
选择性标记
独立抗性基因
多种限制性内切酶的
单一识别位点
较小的分子量
以及不同的拷贝数目
还有最后一点
是比较高的一个生物安全性
图中所示的
是一种在实验室中较为常用的
质粒载体叫pUC18
或者叫pUC18
这个载体它在进入宿主细胞以后
可以形成约500个拷贝
在每一个细胞里
它具有一个多克隆位点
其中包含了各种常用的
限制性内切酶的识别序列
pUC18中
还有一个lacZ基因
也就是我们前面所学的
乳糖操纵子中的一个结构基因
而多克隆位点
正好是位于这个lacZ基因中间
所以你可以想象
当一个外的源基因被插入
放置到这个多克隆位点后
它们的插入
将会打断这个lacZ基因
从而使得该基因没有办法进行正常表达
而LacZ基因
是实际上可以催化的
一种化学物质我们实验室里面常有的
叫X-gal的剪切
而剪切以后的X-gal
实际上会变成一种蓝色的物质
所以从而你可以看到
当一个lacZ基因
被外源DNA片段打断了
那么在含有X-gal的培养基中
这些菌它将无法切割X-gal
从而使得你可以看到一个白色菌落
所以这个lacZ的存在
可以使得我们快速的筛选
获得外源DNA的克隆
从而极大的提高了克隆的效率
此外 在pUC18上面还带有
氨卞青霉素的抗性基因
使得带有这个质粒的菌
可以在带有氨卞青霉素的培养基中生长
从而便于你对这个质粒的筛选
DNA重组技术的第三步
是外源基因与载体的连接
需要对目的基因以及载体
他要进行适当的一个切割过程
在生物体内有很多种DNA酶
包括外切酶
也就是从DNA的
一个末端往DNA链内部切割的这些酶
以及内切酶
也就是说可以识别DNA的链
然后在中间发生切割
而其中在DNA重组技术中得以
大量使用的
是具有位置特异性的
限制性核酸内切核酸酶
这一类酶的特点是说
它们可以在特定的位点
对DNA造成切割
水解这个DNA分子骨架上的磷酸二酯键
它们可以识别
特异的一段DNA序列
比如说有一种酶叫EcoRI或者叫
它的识别的位点是GAATTC
这样的一个双链DNA序列
它们可以识别这个序列
然后在这个序列上造成一个切割
从而使得这2段DNA被分别开
大多数常见的限制性内切酶
都识别大概4-6个不同的碱基对
也有很长的到十几个的
限制性内切酶的切割
是根据DNA断裂后的状态
可分成两种
一种是切割后断裂处
DNA单链上它的碱基数目是一样的
所以当它们这两个单链互补配对的时候
它们最后形成的是一个平的末端
所以这些叫做平末端限制性内切酶
也叫blunt end限制性内切酶
而另外一种
它切割的时候不是正好在它
互补配对的两个碱基之间切
而是一条切在这个地方
另外的一条可能在一个相对远的地方
最后形成了一条链上
的碱基多一点另外一条链上的碱基
少一点
所以这类的酶
产生的末端我们把它叫做
粘性末端或者sticky end
sticky end也就是说
它切割后的DNA双链上
有一条链上会多几个碱基
另外一条链会少几个碱基
而根据多出来的这几个碱基
位于DNA链的5’端还是3’端
我们可以把它叫做5’突出或者3’突出
在DNA重组过程中
一般都会利用限制性内切酶
使得目的基因和你的载体
分别切割
生成了相互配对的或者适配的DNA末端
然后利用另一种
我们的DNA重组技术中常用的
另外一种酶也就是
DNA连接酶 ligase
它们可以把它们这些
靠近在一起的这两个末端
中间没有这个磷酸二酯键的
重新连接起来
形成最后的这个重组DNA
DNA连接酶
是一种能够催化
DNA中相邻的3’ 羟基
和5’磷酸基
末端之间形成磷酸二酯键
并把两段DNA
拼接起来的这个核酸酶
连接酶功能的发挥也同样
需要ATP来提供能量
DNA重组技术的第四步
是将重组完以后获得的DNA
转化进入到宿主的细菌里面去
常用的宿主菌在实验室
用的是大肠杆菌 E.coli
它原因是因为它们生长的很快
操作起来很方便
培养起来也很简单
DNA不能像很多小分子一样
可以随意的通过渗透
通过细胞膜而进入到细菌体内
所以需要特定的方法
去帮助这个DNA进入细菌
常用的方法
我们分为化学法和电击法
它们的基本原理都是
非常相似的
要不就是利用化学物质
要不就是利用高压的电击
使得细菌的细胞膜发生
短时间的损伤
产生了大的孔
从而使得DNA可以通过
DNA重组技术的第五步
是如何去筛选正确的重组体
大家可以想象
在连接反应结束后
的这个体系中
除了正确连接的重组子之外
还包括其他的DNA 对吧
比如说不带有目的基因的载体
自己连起来了
以及目的基因它们自己也许也会连起来
当所有的这些DNA进入到细菌以后
为了获得一个正确的重组体
我们需要进行一个特定的筛选
我们前面介绍了在puc19
或者18它们的载体上代有了抗生素基因
所以我们可以利用这个抗生素基因
把转化后的细菌
放置到一个带有
特定抗生素如氨苄青霉素的培养基上
这样只有带有质粒的菌才可以生长
而质粒中可以带有
或者不带有你所需要插入的这个目的片段
那么接下来
可以利用比如说我们前面的
pUC18质粒中的特性
如利用外源DNA的插入可以导致
lacZ基因的失活而最终
使得细菌菌斑呈现白色
所以我们可以挑取白色的
克隆进行下一步的确认
最终可以确信
我们得到的质粒
中间是包含了我们所需要的目的序列
DNA重组技术的最后一步
是目的基因的表达
获取所需要的蛋白质
进行后续的科学研究
当然如果克隆的目的只是为了
大量的获得一个基因
那么这一步实际上是没有必要的
-绪论
--绪论
-人物访谈——走进精准医学
-第一节 细胞概述
-第一章 细胞生物学基础--第一节 细胞概述
-第二节 细胞膜与物质的跨膜运输
-第一章 细胞生物学基础--第二节 细胞膜与物质的跨膜运输
-第三节 真核细胞的结构
-第一章 细胞生物学基础--第三节 真核细胞的结构
-第四节 细胞的能量代谢
-第一章 细胞生物学基础--第四节 细胞的能量代谢
-第五节 细胞的分裂与分化
-第一章 细胞生物学基础--第五节 细胞的分裂与分化
-第一节 遗传的分子基础
-第二章 分子生物学基础--第一节 遗传的分子基础
-第二节 基因的表达调控
-第二章 分子生物学基础--第二节 基因的表达调控
-第三节 生物技术及其应用
-第二章 分子生物学基础--第三节 生物技术及其应用
-第四节 人类基因组及其遗传疾病
-第二章 分子生物学基础--第四节 人类基因组及其遗传疾病
-第一节 高等植物体的细胞与组织
-第三章第一节 高等植物体的细胞与组织
-第二节 植物的生长
-第三章 高等植物体的结构与功能--第二节 植物的生长
-第三节 植物的生殖和发育
-第三章 高等植物体的结构与功能--第三节 植物的生殖和发育
-第四节 植物的营养与运输
-第三章 高等植物体的结构与功能--第四节 植物的营养与运输
-第五节 植物生长发育的调控
--3.5.6 乙烯
-第三章 高等植物体的结构与功能--第五节 植物生长发育的调控
-第一节 动物的组织
--4.1.5 软骨
--4.1.6 硬骨
--4.1.7 血液
-第一节 动物的组织--作业
-第二节 消化系统
-第四章 高等动物体的结构与功能--第二节 消化系统
-第三节 呼吸系统
-第三节 呼吸系统--作业
-第四节 循环系统
-第四章 高等动物体的结构与功能--第四节 循环系统
-第五节 内环境的控制
-第四章 高等动物体的结构与功能--第五节 内环境的控制
-第六节 内分泌系统
-第四章 高等动物体的结构与功能--第六节 内分泌系统
-第七节 神经系统与神经调节
-第四章 高等动物体的结构与功能--第七节 神经系统与神经调节
-第八节 生殖与胚胎发育
-第四章 高等动物体的结构与功能--第八节 生殖与胚胎发育
-2020年秋季学期普通生物学期中考试