发展史话资料文件与下载

在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，这种新的仪器分析方法称为高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，以下简称HPLC)。在过去三十多年里，HPLC已经成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一，1994年，HPLC的市场销售量是14亿美元，就是一个较好的证据。现在，HPLC几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样，在目前已知的有机化合物中，若事先不进行化学改性，只有20%的化合物用气相色谱可以得到较好的分离，而80%的有机化合物则需HPLC分析。目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是独领风骚。在短短的三十多年里，HPLC从初创一下发展成为成熟而广泛应用的分析方法，的确是化学史上一件引人注目的事情。在化学发展中，化合物性能与结构的确定有着重要的历史地位，尤其是有机、高分子化合物结构的确定更是影响着化学发展的进程，所以说，高效液相色谱也有着同样重要的历史意义。高效液相色谱的出现、发展和完善过程直接影响着有机、高分子化合物的分离和分析，从而推动了化学学科的发展。

科学史上第一次提出“色谱”名词并用来描述这种实验的人是俄国植物学家茨维特(Tsweet)，他在1906年发表的关于色谱的论文中写到：将一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，然后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，他把这些色带称之为“色谱图”(Chromatogram)。遗憾的是，在随后的二十年内这一新的分析技术都没有得到科学界的注意和重视，直至1931年，库恩(Kohn)报道了他们关于胡萝卜素的分离方法时，色谱法才引起了科学界的广泛注意

1941年，马丁(Matin)和辛格(Synge)用一根装满硅胶微粒的色谱柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离，建立了液液分配色谱方法，他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。1944年，康斯坦因(Consden)和马丁(Matin)建立了纸色谱法。1949年，马丁建立了色谱保留值与热力学常数之间的基本关系式，奠定了物化色谱的基础。1952年，马丁和辛格创立了气液色谱法，成功地分离了脂肪酸和脂肪胺系列，并对此法的理论与实验做了精辟的论述，建立了塔板理论。1956年，斯达(Stall)建立了薄层色谱法。同年，范õ底姆特(VanDeemter)提出了色谱理论方程；后来吉丁斯(Gid-dings)对此方程作了进一步改进，并提出了折合参数的概念。这一系列色谱技术和理论的发展都为HPLC的问世打下了扎实的基础。

在1966年以前，许多科学家已经从事了经典液相色谱的研究，这种广泛的基础性研究对后来HPLC的发展有着重要影响。从现在的观点来看，当时的液相色谱分析仪器是较为简单和原始的。六十年代早期，气相色谱(GC)是当时混合物分离的一个热门研究课题，有着许多重要的进展。但当时的气相色谱遇到了一个难题：由于蛋白质和其它极性化合物难以气化，同样对高分子或极性的混合物来说，气相色谱无能为力。这时分析化学家们把目光转向了液相色谱，液相色谱也的确令人兴奋地从蛋白质中分离出了纯的化合物，但使用液相色谱又出现了一个新的问题：分离时间的问题。当时所使用的色谱柱效率非常低，具有代表性的柱子是一米来长或更长，为了获得必要的分辨率，有时还得使用多根柱，液体流动的产生靠重力，其流动速度是每小时几毫升或更少，无计算机自动操作仪器和进行数据收集，尽管这时的数据收集并不难，那也是因为产生数据的速度比较慢的缘故。当时的生物学工作者往往要经过好几年的努力才能从一个组织中把蛋白质完全分离出来。由于当时气相色谱比液相色谱完善，往往把一些高分子或大极性分子衍生成低极性的小分子进行气相色谱的分析，而不采用液相色谱进行分析。

早在1941年，马丁和辛格就预言了小微粒固定相和高压强在色谱分离中的必要性。在马丁和辛格的开创性工作之后，吉丁斯、哈伯(Huber)和其他人进一步指出：通过减少液相色谱仪中填充颗粒的直径和使用高压增强流动速度，液相色谱能够用于HPLC模式。1966年，斯尼德(Snyder)意识到柱效率和自动液相色谱分离需要进一步的检验，这使得他的实验室在HPLC方面取得了独特的进展。以吉丁斯为代表的许多研究者从气相色谱领域迈进HPLC领域，这使得许多在六十年代在气相色谱领域中所解决的问题能够迅速应用到HPLC的研究方面。

在仪器发展方面，HPLC的第一个雏形是由斯坦因(Stein)和莫尔(Moore)于1958年发展起来的氨基酸分析仪(AAA)，这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析，由于这种研究的重要性，别的研究者也被吸引来进行这一方面的重要课题的研究，最终直接促成了HPLC方法的建立。在此期间，哈密顿(Hamiton)在柱效率和选择性方面的成就而使得他的工作特别有价值。在六十年代早期的相关进展是莫尔(Moore)发展起来的凝胶渗透色谱(GPC)。不久以后，华特斯(Waters)有限公司制造了商业GPC仪，这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC分离。在1968～1971年间，推出了第一台普遍适用的HPLC商用系统。这种新的色谱仪是由科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯(Preiss)和里普斯克(Lipsky)等人研制发明的。

在1971年前，如果问到普通HPLC使用者在仪器方面有什么最需要改进时，答案将是“开发一个好的检测器”，当时没有一个灵敏、宽波长的商用检测器。到了1971年，用于GC或TLC的一些重要工具对促进HPLC灵敏度的发展作了重要贡献。我们知道，仪器分辨率(Rs)依赖于容量因子(k)、选择性常数A和柱效率(N)，现在用泊尼勒(Purnell)方程表达：Rs=1/4(A-1)/AN1/2[k/(1+k)]。然而，1971年前，普遍使用的方法是改变固定相来作为调整选择性参数的方法。改变固定相优于改变流动相可能基于以下两个方面的原因：第一，研究者在GC研究中不倾向于改变流动相来改变选择性；第二，使用液—液色谱时，改变流动相常常需要固定相上的同时改变，以保持两种液相的不相混溶性。

1971年后：HPLC分析的建立和逐步完善。当填装微小颗粒的色谱柱达到了尽可能的高效值(N)后，分析化学家们认识到流动相的变化对于多样选择性将更有用，当时广泛使用的方法逐一实验各种溶剂，对于吸收液相色谱的分离来说，这个过程可用“等酸洗脱系列”来帮助完成。然而，大量可能溶剂的选择需要一个冗长的逼近方式，这时可以根据选择性来划分组试剂，以避免尝试相似选择性的溶剂。第一次尝试溶剂分类方式是基于选择性参数。几年后，由罗歇雷德(Rohrschneider)进行的实验研究提供了一种更为先进的溶剂分类系统，斯尼德在进一步的实验基础上，把溶剂用一个三角形表示，80个普通溶剂被分为8个选择性组。另一重要发展是关于HPLC的劳伯-伯尼勒(Laub-Purnell)窗口图的推广，这种HPLC方法在使用计算机之后得到了更好的发展。而后，由计算机评估发展起来的反相方法由格拉基(Glajch)和科克兰等人介绍之后，成了世界上该种实验研究的模型。到八十年代中期，在大多数试样的高效分析中发展起来了系统分析和最大选择性的方法。一个相关的发展是使用计算机模拟作为实际实验的替换，不象大多HPLC实验者，计算机能够承担起繁重的数学计算。理论和实验的结合使得早在1979年就允许计算机预测HPLC分离，杜邦公司于1982年创建的“探索者”(Sentinel)色谱仪利用了计算机。到了1986年，理论发展到在不同实验条件下允许两个以上的实验同时进行预测分离，在真实实验的基础上用计算机很容易实现逐次逼近法。现在，为促进HPLC分离的合理方法是计算机模拟与实际实验相结合。

在仪器方面，近年来，毛细管液相色谱的理论塔板数已大大提高，电化学和激光诱导荧光法已获得很大发展，对紫外可见光谱的快速扫描检测，使液相色谱能提供的信息量大幅度增加，为化学计量学中的许多手段，如模式识别等提供了重要的应用领域。

到了八十年代中期，HPLC分析技术很明显成了一种成熟的技术，激动人心的新发展日益减少，许多领先研究者纷纷转向相关领域的研究，如超临界流体色谱法(SFC)毛细管电泳(LZE)、制备色谱法(PC)等等。尽管如此，我们并不能够说HPLC方法已经尽善尽美了。它在有些方面仍然需要进一步的完善，如HPLC系统与计算机更完善的配合、专用固定相的研制以及群论与HPLC理论的结合等等。

HPLC技术在我国的发展历史。70年代初期，中国科学院大连化学物理研究所就开展了HPLC的研究，与工厂合作生产出了液相色谱固定相，并出版了高效液相色谱的新型固定相论文集，编写了高效液相色谱讲义，而且在色谱杂志上以讲座的形式进行了系统的介绍，同时还举办了全国性的色谱学习班。80年代初，卢佩章等人开展智能色谱的研究，1984～1989年间研制成功了我国第一台智能高效液相色谱仪。十多年来，HPLC逐渐从开始仅为少数研究实验室拥有发展到目前为更多的生产、研究和检验部门所掌握，广泛用于质量控制、分析化验和制备分离。

综上所述，高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上，引入气体色谱的理论和技术，并对经典液相色谱法的固定相、设备、材料、技术及理论应用进行了系列改进而发展起来的。在高效液相色谱的发展过程中，分析化学家们主要进行了以下突破性几项工作：第一，色谱柱的改进和完善，主要包括固定相填充微粒粒度的改进和流动相溶剂的选择；第二，仪器方面的改进工作，加入了一个高压泵，缩短了分离时间，高效液相色谱有效塔板数比传统液相色谱提高了数百倍，提高了分离效率；第三，与计算机联用之后，自动化程度大大提高。