视频在线视频

上次课我们介绍了

液相色谱仪的主要部件

知道了液相色谱

与气相色谱的基本理论

和基本概念是一致的

均遵循塔板理论和速率理论

两者最大的区别在于流动相的不同

液体的扩散系数

比气体的小4-5个数量级、

粘度比气体的大100倍、

密度比气体大1000倍

这些明显的差别

将影响色谱分离过程

色谱分离机制又是影响

色谱分离的关键因素

因此，了解液相色谱分离的

不同类型及其原理

有助于液相色谱法的运用

下面从3个方面来介绍

一、高效液相色谱法

主要类型简介

根据分离机理的不同

可分为以下类型：

液-液分配色谱

液-固吸附色谱

离子交换色谱

离子对色谱

离子色谱

排阻色谱

亲和色谱

需要注意的是

每种色谱法通常存在

一种起支配作用的主要机理

同时可能还存在其他作用机理

下面分开介绍

二、液相色谱分离的主要类型

1. 液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体

互不相溶

基于样品分子在流动相

和固定相间的溶解度存在差异

组分在两相间进行分配

分离的顺序决定于分配系数

分配系数大的组分

保留值大、出峰晚

固定相早期采用

固定液涂渍的方式

但由于固定液在流动相中

存在溶解损失等问题

导致固定液流失、

分析重现性较差

20世纪70年代产生了

化学键合固定相

即将各种不同有机基团

通过化学反应键合到

惰性载体如硅胶表面的

游离羟基上

有效解决了固定液流失的问题

为色谱分离开辟了

广阔的应用前景

化学键合固定相的

基本原理如图所示

根据基团的极性可以分成

非极性和极性2种键合固定相

非极性键合固定相

键合在载体表面的功能分子

是烷基、苯基等非极性有机分子

如最常用的ODS柱

或碳18柱就是最典型的代表

其极性很小

极性键合固定相

键合的是具有二醇基、

醚基、氰基、氨基等

极性基团的有机分子

基于固定相与流动相

相对极性的不同

液相色谱可分为

正相色谱和反相色谱

正相色谱

就是极性固定相

和非极性（或弱极性）

流动相组成的液相色谱体系

代表性固定相如改性硅胶、

氰基柱等，流动相如正己烷等

吸附色谱也属正相HPLC

色谱分离的时候极性弱的

组分先出峰

适于分离极性物质

反相色谱：与正相色谱相反

即非极性固定相和

极性流动相组成的色谱体系

代表性固定相是

十八烷基键合硅胶

（简称ODS柱或碳18柱）

流动相主要有甲醇、乙腈、水

是目前应用最广泛的

液相色谱分离模式

出峰顺序与也正相相反

极性强的组分先出峰

适于分离弱极性(或非极性)的物质

2. 液-固吸附色谱

以固体吸附剂作为固定相

吸附剂通常是些多孔型固体颗粒

表面存在吸附中心

当液体流动相通过固定相时

吸附剂表面的活性中心

就要吸附流动相分子

同时，当试样分子

被流动相带入柱内

只要它们在固定相

有一定程度的保留就要取代

一定数量的被吸附的

流动相溶剂分子

即在固定相表面发生竞争吸附

根据物质在固定相上的

吸附作用强弱不同来进行分离

固体吸附剂有活性硅胶、

氧化铝、活性炭等

最常用的是5～10μm的硅胶

流动相主要是弱极性

有机溶剂或非极性

与极性溶剂的混合溶液

如正构烷烃、二氯甲烷/甲醇、

乙酸乙酯/乙腈等

由竞争吸附的原理可以看出

液-固吸附色谱适用于

分离相对分子质量中等的

油溶性试样

对具有不同官能团的化合物

和异构体有较高的选择性

如农药异构体，石油中烷烃、

烯烃、芳烃的分离

其实凡是能用薄层色谱法分离的

都可以用液固色谱法分离

分离时分配系数大的组分

吸附剂对它的吸附能力强

保留值就大

强极性试样由于

吸附能力太强难于洗脱而不适用

3. 离子交换色谱

是指作为固定相的

离子交换树脂携带一些带电基团

这些带电基团通过

静电作用与流动相中

带相反电荷的离子结合

如果流动相中其他带

相反电荷的离子进入色谱柱后

样品离子便与流动相

离子竞争固定相表面的电荷位置

因竞争力的差异使样品得到分离

亲和力大的

保留时间长

按交换树脂释放和交换的

离子种类可分为阳离子交换

和阴离子交换

故特别适用于分析离子

或能电离的化合物

如无机离子、氨基酸、核酸等

然而离子交换色谱分析

很多大分子或离解较弱的有机离子时

采用正相色谱由于

硅胶的吸附能力太强

致使被测物质保留值太大、

出现拖尾峰

甚至不能被洗脱

反相色谱

又由于非极性（或弱极性）

固定相中的保留太小而很快出峰

对这类物质可以采用离子对色谱

4. 离子对色谱

基本原理是：

将一种（或多种）

与样品离子电荷相反的离子

（称为对离子或反离子）

加入到流动相（或固定相）中

使其与样品离子结合生成

弱极性的疏水性离子对

此离子对不易在水中离解

而迅速进入有机相中

使其能够在两相之间进行分配

以多孔硅胶为固定相

将对离子涂渍在固定相上

再用有机溶剂作流动相

这种称为正相离子对色谱

常用来分析有机羧酸、磺酸盐、

有机胺类等

分离阴离子的对离子

常用烷基铵类如四丁基铵

或十六烷基三甲铵正离子等

分离阳离子的对离子

常用烷基磺酸类

如十二烷基磺酸负离子等

反相离子对色谱常用

非极性的疏水固定相

如碳18柱

含有对离子的

甲醇-水或乙腈-水

作为流动相

试样离子进入流动相后

生成疏水性离子对后

在两相间分配

离子对色谱法

(特别是反相)解决了以往

难以分离的混合物的分离问题

诸如酸、碱、离子

和非离子的混合物

特别是一些生化试样

如核酸、核苷、生物碱

以及药物等分离

5. 离子色谱

离子分析中由于洗脱液本底的存在

导致测量时电导变化很小

检测不灵敏

有研究人员发现

在离子分析柱后

再连接一根抑制柱

装有与分离柱填料

带相反电荷的离子交换树脂

可以除去流动相中

被测离子的反离子

从而降低洗脱液的背景电导

提高检测灵敏度

于是产生了离子色谱法

也因此被部分学者

作为一门新的色谱分离技术

从液相色谱法中独立出来

抑制柱离子色谱的原理

以阴离子分析为例

如下所示

具体介绍可以参考

教材等有关内容

离子色谱的特点有：

① 分析速度快：

可在数分钟内完成试样分析

② 分离能力高：

适宜条件下

可分离常见的各种阴离子混合物

③ 特别适合分离混合阴离子

④ 仪器流路采用全塑件

玻璃柱，耐腐蚀

随着技术的迅速发展

各种抑制装置

及无抑制方法的出现

也出现了不需要抑制柱的

非抑制型离子色谱

检测器也扩展到

电导检测器之外的其他检测器

应用范围也由无机阴、

阳离子的分析扩展到

糖类、生物胺、有机酸等

生物样品中的

某些复杂离子的分析

6. 空间排阻色谱SEC

以多孔性凝胶为固定相

根据凝胶孔隙大小与样品

分子尺寸间的相对关系

进行分离的方法

凝胶表面含有许多不同尺寸的

孔穴或立体网状物质

小分子可以扩散到凝胶孔隙

由其中通过，出峰最慢

中等分子只能通过

部分凝胶孔隙，中速通过

大分子被排斥在孔隙外

出峰最快

溶剂分子最小，最后出峰

因为分子尺寸

一般随分子量的增加而增大

所以根据分子量

表达分子尺寸比较方便

常用于分离相对分子质量

在100-105范围内的化合物

主要用来获得聚合物的

相对分子量的分布情况

但它不能分辨分子大小

相近的化合物

一般说来分子量的差别

需在10%以上时才能得到有效分离

7. 亲和色谱

基本原理是：

利用生物大分子

和固定相表面存在的某种特异性

亲和力进行选择性分离

具体操作为：

将一对能可逆结合

和解离生物分子的一方

作为配基（也称为配体）

与具有大孔径、亲水性的

固相载体相偶联、制成

专一的亲和吸附剂

再用此亲和吸附剂填充色谱柱

当含有被分离物质的

混合物随着流动相流经色谱柱时

亲和吸附剂上的配基

就有选择地吸附

能与其结合的物质

而其他的物质不被吸附

从色谱柱中流出

使用适当的缓冲液

使被分离物质与配基解吸附

即可获得纯化的目的产物

如果分离的目的

只是除去溶液中某种分子

那么只要分子能与介质结合即可

可以不必进行洗脱

再生时调整流动相

将杂质洗脱即可

因此，亲和色谱可以用来

从混合物中纯化或浓缩某一分子

也可以用来去除

或减少混合物中某一分子的含量

三、不同色谱类型间的关系

如图所示

选择时主要参考物质的

分子量大小、水溶性、

离子性及其极性等性质

今天我们了解了

液相色谱分离的常见类型

知道了由于流动相和固定相之间

作用机理的不同导致了

液相色谱分离原理的不同

下次课我们介绍液相色谱的

流动相和固定相的选择

揭开液相色谱分离背后的

真正原因

好了，下次课见