视频：荧光光谱及分析方法在线视频

荧光光谱是进行物质分析的

重要工具

本节我们就来学习

荧光光谱的性质和测定方法

辨别人民币的真伪时

可见光下，为什么

看不到人民币的荧光防伪标志

用紫外灯照射

荧光标识很清晰的显现出来

这是因为荧光分子对光的吸收

具有选择性

不同的波长的入射光

具有不同的激发效率

既然荧光属于光致发光

那么照射光的波长如何选择呢

也就是如何选择荧光的激发波长

固定测量波长为荧光

最大发射波长

然后改变激发波长

根据所测得的荧光强度

与激发光波长的关系

即可绘制激发光谱

如右图所示

固定发射波长620nm

扫描激发波长

得到如图所示的激发光谱图

激发光谱曲线的最高处

处于激发态的分子最多

荧光强度最大，此时激发波长

也就是图中的290nm

即为该物质的最大激发波长

固定激发光波长

为其最大激发波长

并保持强度不变

然后测定不同的波长时

所发射的荧光强度

即可绘制荧光光谱

磷光光谱的绘制过程与此相同

如右图所示

固定激发波长为290nm

扫描发射波长

即可得到如图所示的发射光谱图

在荧光和磷光的产生过程中

由于存在各种形式的

无辐射跃迁, 损失能量

所以它们的最大发射波长

都向长波方向移动

以磷光波长的移动最多

而且它的强度也相对较弱

在溶液荧光光谱中

所观察到的荧光发射波长

总是大于激发波长

λem>λex, Stokes

于1852年首次发现这种波长位移现象

故称Stokes位移

斯托克斯位移说明

在激发与发射之间

存在着一定的能量损失

能量损失可能包括

(a) 激发态分子由于

振动弛豫或/和内转化的

无辐射跃迁过程

而迅速衰变到S1电子态的

最低振动能级

这是产生其位移的主要原因

(b) 辐射跃迁可能使激发态分子

衰变到基态的不同振动能级

然后通过振动弛豫

进一步损失能量至最低振动能级

也造成能量的损失

(c) 溶剂效应以及激发态分子

可能发生的反应

也会加大斯托克斯位移现象

由于荧光发射是激发态分子

由第一激发单重态的最低振动能级

跃迁回基态的各振动能级所产生的

所以不管激发光的能量多大

能把电子激发到何种激发态

都将经过振动弛豫及

内转化跃迁至第一激发

单重态的最低能级

然后发射荧光

因此，通常荧光光谱只有一个发射带

且发射光谱的形状与激发波长无关

例如，蒽在乙醇溶液中

分别以不同的激发波长进行激发

所得到的发射光谱形状一模一样

只是荧光强度不同而已

通常荧光发射光谱

与它的吸收光谱

与激发光谱形状一样

成镜像对称关系

下图表示苝的本溶液的吸收光谱

和荧光发射光谱

可以看出

它的荧光发射光谱

与它的吸收光谱之间存在着

镜像对称关系

应用镜像对称规则

可帮助判别某个吸收带

是否属于第一吸收带

如不是吸收光谱镜像对称的

荧光峰出现

表示有散射光或杂质存在

荧光发射光谱与它的吸收光谱

之所以成镜像对称关系

是因为荧光光谱是激发态分子

从第一电子激发单重态

最低振动能级，辐射跃迁至

基态中各不同能级形成的

而基态上的各振动能级分布

与第一激发态上的各振动能级

分布类似

根据Frank-Condon原理

如吸收光谱中某一振动带的

跃迁概率大

则在荧光光谱中该振动带的

跃迁概率也大

因此吸收光谱的形状

与荧光发生光谱的形状呈镜像对称关系

荧光光谱反应荧光物质的特性

用于荧光物质的鉴别

此外，荧光光谱也可以

给出分子在特定波长下的荧光强度

从而实现对该物质的定量分析

溶液的荧光强度(If )

与溶液吸收的光强度(Ia )

及荧光量子产率(Фf）之间

有如下关系

由Lambert-beer定律

及吸收光强度的概念

可推导出，当ebc ≤0.05时

有如下关系式： 从关系式中

我们可以看出，在稀溶液中

荧光强度If与物质的浓度C呈线性关系

与荧光类似

溶液的磷光强度(IP)

与低浓度下磷光物质浓度C之间

也有如下关系式

需要注意的是

随着溶液浓度的进一步增大

将会出现发光强度

不仅不随溶液浓度线性增大、

甚至出现随浓度的增大

而下降的浓度效应

因此，荧光强度与荧光物质的浓度

成正比例

这种线性关系

只有在极稀溶液中才成立

例如，浓度较大时

蒽的荧光发射光谱的短波长端

与其吸收光谱的长波长端重叠

产生自吸收现象

而降低了溶液的荧光强度

用于测量荧光或磷光的仪器

主要由四个部分组成：

激发光源、样品池、

双单色器系统、和检测器

与紫外可见分光光度计相比

荧光分光光度计的特点是：

需要两个独立的单色器

并且光源与检测器通常成直角

为了便于选择激发光的波长

理想的激发光源

需要足够的强度

在所需光谱范围内有连续的光谱

其强度与波长无关

即光源输出是连续平滑等强度的辐射

光强要稳定

荧光光谱仪最常用的光源是氙灯

高压汞灯是线状光源

可以发出313、365、

405、436和546nm的光

也是较常用的荧光光源

单色器一般为光栅和干涉滤光片

荧光光谱仪有两个单色器

第一块为激发单色器：

在光源与样品池之间

用于选择激发光波长

第二块为发射单色器：

在样品池与检测器之间

用于选择发射波长

荧光仪用的样品池材料

要求无荧光发射

通常采用石英材料制成

样品池的四壁均光洁透明

而两面透光

两面磨砂的比色皿

用于紫外可见分光光度计中

荧光的强度通常比较弱

因此要求检测器要有较高的灵敏度

一般为：光电倍增管、

光导摄像管（OMA）、

电子微分器、

电荷耦合器件阵列检测器

荧光仪的读出装置

有读字电压表或记录仪

现代仪器都配上计算机

进行自动控制

和显示荧光光谱及各种参数

荧光检测的方式有：

直角测量、照射面荧光测量、

直线测量三种方式

其中直角测量方式

是最常见的一种检测方式

由于荧光发射是朝着各个方向的

直角方向的检测可以避免

激发光的透射部分

进入发射单色器

同时还减少了低浓度溶液中的瑞利散射、

拉曼散射以及悬浮液、

悬浊液的丁铎尔散射

(b) 是照射面的荧光测定方式

入射光进入样品的

深度小于1 mm

此法有利于降低浑浊、

固体样品的散射、

强吸收、 高浓度样品的荧光再吸收

(c) 是直线检测方式

由于斯托克斯位移

激发波长与发射波长不同

因此沿激发光方向

也应该可以检测荧光

但未被吸收的入射辐射进入单色器

会引起严重的杂散光干扰

因此这种测量方式

在荧光仪器中很少见

此图为日立F-4500荧光分光光度计的

光学系统图

采用的是直角测量的方式

荧光分析法具有以下几个特点：

（1）灵敏度高

与紫外可见分光光度法比较

荧光是从入射光的直角方向检测

即在黑背景下检测荧光的发射

所以，一般来说

荧光的灵敏度要比

紫外可见分光光度法高2——4个数量级

（2）选择性强

荧光法既能依据特征发射

又能依据特征吸收来鉴定物质

假如某几个物质的发射光谱相似

可以从激发光谱的差异把他们区分开来

而如果他们的吸收光谱相同

则可用发射光谱来区分

（3）样品量小，操作简便

工作曲线的动态线性范围宽

（4）提供比较多的物理参数

荧光分析法能提供包括激发光谱、

发射光谱、以及荧光强度、荧光效率、

荧光寿命等许多物理参数

这些参数反映了分子的各种特性

能从不同角度提供被研究的分子信息

荧光分析法

可用于定性和定量分析

定性分析：将样品的荧光物质的

激发光谱和荧光光谱的形状、

位置与标准溶液光谱图进行比较

从而鉴别样品是否

与标准溶液是同一种物质

定量分析：是依据同种物质的稀溶液

其产生的荧光强度与浓度呈线性关系

进行物质的浓度测定

常用的分析方法为：

直接测定法和间接测定法

直接测定法要求

被分析物本身具有荧光

通常采用相对测量方法

如工作曲线法

每次测绘工作曲线最好用

同一种稳定的荧光物质校准仪器的读数

间接测定法是指被分析物

本身不发荧光

或者因荧光量子产率太低

而无法进行直接测定

便只能采用间接测定的办法。

如：光衍生法、荧光猝灭法、

敏化荧光法等

在药物检测方面

利用荧光分析法对

肾上腺素、青霉素、

普鲁卡因等具有荧光性质的

有机化合物可以直接测定

不产生荧光的甾族化合物

如氢化可的松经浓硫酸

处理后可以发绿色荧光

本身不具荧光的无机化合物

可与有机荧光试剂配位

构成发光体系后进行测量

或者某些金属离子

可以猝灭荧光试剂

利用荧光猝灭工作曲线法

测定金属离子的含量

目前利用荧光分析法

进行测定的元素大约有70余种

常用的荧光试剂：

有8-羟基喹啉、2-羟基-3-萘甲酸、

2,2′-二羟基偶氮苯、安息香等

荧光分析法还可以用于

生物基因的检测

DNA因自身荧光效率低而不易检测

但用某些荧光分子

作为探针进行标记后

可通过探针分子的

荧光变化来研究DNA

基因检测领域

荧光染料正逐步取代同位素标记物

本次课的内容到此结束

谢谢观看