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前面我们学习了

液相色谱的分离原理、

固定相与流动相的类型及其选择

那么如何才能更好的运用

液相色谱法

实现混合组分的分离呢

比如这份维生素标准品的

液相色谱图

还能进一步的优化分离吗

本节课将告诉我们

液相操作条件的

优化选择与实际应用

下面从4个方面来介绍

一、影响液相色谱分离的因素

通过色谱分离基本理论的学习

我们知道液相色谱

与气相色谱均遵循塔板理论

和速率理论

评价色谱分离好坏的依据

都是范氏方程

研究发现

两者的H-u曲线形式

基本一致

但液相色谱的最佳流速

明显小于气相色谱

主要是由于液体的

扩散系数比气体的

小4-5个数量级

当流速u大于0.5的时候

纵向扩散项很小

可以忽略不计

将液相色谱的

范氏方程完整表达出来

如公式所示

由于液体的黏度

比气体大一百倍

密度约为气体的一千倍

故传质阻力项成为

影响柱效的主要因素

降低传质阻力是

提高柱效的主要途径

由速率方程可以看出

降低固定相粒度

和提高装填的均匀性

可以提高柱效

液相色谱中

不可能通过大幅提高柱温

来改善传质

改变流动相的组成、极性、

比例则成了改善分离的

最直接办法

二、HPLC的操作条件

由范氏方程分析

和液相色谱仪的结构可以得出

影响液相色谱分离的

操作条件主要有：

分离模式、检测器、

色谱柱和流动相等

下面分开介绍

各自最佳条件的选择

三、HPLC操作条件的选择

1. 分离模式的选择

色谱分离的关键在于

正确选择色谱分离方法

选择的主要根据是：

样品的相对分子质量的大小

在水中和有机溶剂中的溶解度、

极性和稳定程度

以及化学结构等物理、化学性质

先看相对分子质量

一般以2000为界

对相对分子质量大于2000的

首先考虑空间排阻色谱法

2000以下的再结合样品的

其他性质考虑液固吸附、

液液分配或离子交换色谱等方法

如果分子量很小（如M＜200）

挥发性较好且不易分解的样品

首选气相色谱

（2）溶解度

水溶性样品最好用离子交换色谱法

和液液分配色谱法

微溶于水，但在酸或碱存在下

能很好电离的化合物

也可用离子交换色谱法

油溶性样品或相对非极性的混合物

可用液固色谱法

（3）化学结构

若样品中包含离子型

或可离子化的化合物

或者能与离子型化合物

相互作用的化合物

例如配位体及有机螯合剂

可首先考虑用离子交换色谱

但空间排阻和液液分配色谱

也都能顺利地应用于离子化合物的分离

异构体的分离可用液固色谱法

具有不同官能团的化合物、

同系物可用液液分配色谱法

对于高分子聚合物

可用空间排阻色谱法

液相色谱分离类型的选择

可参考这个图

对不同的因素做了详细的分类

在刚开始不太清楚怎么选择的时候

可以多参考国家标准

和有关文献资料

综合分析之后

结合实验室现有的仪器设备

进行选择

没有相关设备的

可以寻求第三方

或者其他检测机构

或者购买

2. 检测器的选择

参考9.1检测系统有关内容

很多时候受分离模式决定

这个表格中列出了

几种常用检测器之间的对比

可以作为选择参考

3. 色谱柱的选择

这是色谱分离的关键

要求柱效高、

柱容量大和性能稳定

（1）固定相：

气相色谱中的固定液原则上

都可以用于液相色谱

选用原则也与气相色谱一样

但液相色谱柱的

制备技术要求非常高

一般很少自行制备

都是根据需要选择购买

选择时重点关注分离模式

具体类型参考9.2

色谱分离类型有关内容

（2）柱温：

柱温会影响流动相的极性

以及组分的k

从而影响色谱分离

如图所示

柱温由室温升温到45℃时

4、5号峰重叠

继续升温到60℃时

5号峰先于4号出峰

不过液相色谱一般采用

室温条件分离

或者控制在25 ~ 65℃范围内

某个固定温度

（3）流速：如图所示

当大于0.5cm/s时

H～u曲线是一段斜率不大的直线

降低流速，对提高柱效不明显

色谱柱一般有个最佳的流速范围

可以参考使用

比如柱内径4.6mm装填

5微米填料的常规液相色谱柱的

最佳流速范围为0.8-1.0mL/min

不过在实际使用中

可以根据需要适当调整

作为一个调整R和tR的参数

流速增大，保留时间缩短

分离度变差

4. 流动相的选择

重点关注：

（1）流动相的组成：

即溶剂强度

对应于分离模式

主要是流动相的类别与配比的选择

（2）洗脱方式

有等度和梯度洗脱2种

保持流动相组成配比不变的

称为等度洗脱

在液相色谱分离过程中

随时间不断改变流动相的

组成与配比

即程序改变流动相的强度

极性、pH或离子强度等

称为梯度洗脱

梯度洗脱适合于

待测组分之间分配比

相差较大的复杂混合物的分离

目的在于改善分离效果

并缩短分析时间

如图a所示

通过降低甲醇的起始浓度

实现1、2号峰的分离

图b则通过提高甲醇

起始浓度实现3、4号峰的分离

液相色谱分离中

非常关键的一点就是

学会根据色谱分离的实际情况

优化梯度洗脱程序

上面介绍了4个方面的影响

色谱分离的条件选择

优化的核心原则就是

在保证组分分离度

和灵敏度的前提下

实现快速分析

评价指标主要是塔板数n高、

选择性强、R足够、tR短

四、HPLC的应用

液相色谱适用于各种沸点高、

极性强、热稳定性差

但能溶于溶剂的物质

已广泛应用于成分分析、

生物化学、环境污染、

医药等领域的分析

据估计约80%有机物

可采用液相色谱进行分析

1.成分分析：包括

各种作物、畜牧产品、

饲料及食品等的成分分析

食品添加剂

如甜味剂、着色剂、防腐剂、

香料、人工合成色素等、毒物

如黄曲霉素

或者非法添加物等的分析

如对我国奶粉业造成

重大影响的三聚氰胺的检测

中国农业部颁布的国家标准中

第一法是液相色谱-质谱法

第二法：高效液相色谱法

随着技术的发展

逐渐向超高效液相色谱发展

《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》

2016年食品安全国家标准

5种测定方法中

有3种基于液相色谱法

2.在生物化学和生物工程中的应用

如核酸、核苷酸、

DNA和 RNA 碎片的序列

氨基酸、肽、蛋白质、

酶、糖；人参皂甙等的检测

如图所示

17种氨基酸标准样品

HPLC色谱图

30多分钟完成测定

这是5种核苷酸标准品的

高效液相色谱图

这是5种银杏酸和5种银杏内酯的

高效液相色谱图

3.环境污染物的分析

如多环芳烃类、多氯联苯、

氨基甲酸酯类农药、

硝基化合物等的检测

如图所示

16种多环芳烃标准品的

液相色谱色谱图

可用于分析大气、

食品中的多环芳烃污染

这种由于环境污染

导致大气中多环芳烃超标

进而造成蔬菜水果等

多环芳烃超标的也越来越多

因此，保护环境

真的就是保护我们自己

4.无机分析

包括络离子、阴离子、

稀土和稀有元素的分析

如图所示，7种阴离子的

标准HPLC色谱图

用于分析水中无机阴离子

5.石油化工分析：

如产品质量控制、

表面活性剂、染料等分析

如图所示，染发剂中

禁限用成分的液相色谱检测

以及化妆品中的氢化可的松

残留的液相色谱检测

6.医药方面：

主要用于分析药物含量

如可同时测定

维生素B、D、A、E的含量

体内药物残留和代谢物等

如图所示

人血液制品中糖及糖醇的

液相色谱分析

以及复方丹参片中

三七总皂苷的液相色谱分析

7. 指纹图谱分析：

某些复杂物质

比如中药、某种生物体

或某种组织或细胞的DNA

采用一定分析手段

得到的能够标示其化学特征的

色谱图或光谱图

主要应用包括中药指纹图谱、

DNA指纹图谱和肽指纹图谱

指纹图谱技术已成为

生物多样性研究

和品种鉴别的重要手段

如图所示的是

我们采用5种不同方法

提取余甘子多酚溶液的

液相色谱指纹图谱

能分析出不同方法

对多酚提取的影响

好了，学习了液相色谱操作条件的

优化选择与实际应用

我们需要到实验室去实践

只有经过实践才能感受到

液相色谱分离的神奇魅力

让我们实验室再见吧