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看着色香味俱佳的各类食品饮料

心中充满了向往

但是三聚氰胺、瘦肉精、

漂白馒头等安全事件

又让人倍感担心

在新闻报道中时常见到

实验人员运用各种仪器进行分析检测

其中液相色谱比较常见

下面一道走进液相色谱分析的世界

首先了解下高效液相色谱法

主要从以下4个方面来介绍

一、高效液相色谱法简介

高效液相色谱法（HPLC）

是70年代初期发展起来的

一种以液体为流动相的

新色谱技术

它是在经典色谱理论基础上

引入气相色谱理论

采用高压泵、高效固定相

和高灵敏度检测器等新技术

而建立的一种高效色谱分析技术

迄今

高效液相色谱法得到了快速发展

已广泛应用于各个领域

比如《中国药典》2000版

2691种药品中

只有279项采用液相色谱分析

但2020版中大多数

都增加了液相色谱的分析方法

这主要得力于液相色谱填料

由薄壳型填料

发展到5~10μm球型

和无定型微粒硅胶

再到高度均匀

甚至单分散1~3μm硅胶基质球形填料

塔板数也由每米3000

提高到15~30万

再加上新的液相色谱

分离模式和方法不断产生

极大的提高了HPLC的分离效能

HPLC将成为

未来多组分混合物分离分析的首选方法

二、高效液相色谱法的特点

（1）高压：

一般可达150～400个大气压

（2）高速：

流速可达1～10 mL/min

（3）高效：

新型固定相的不断开发

使分离效率极大提高

（4）高灵敏度：

进样量小，一般几微升

检测器灵敏度高

（5）适用范围广：

一般认为约有80%的有机化合物

可以采用HPLC来分析

包括高沸点、热不稳定有机物

及生化试样的分离分析

前面，我们学习了

气相色谱法及其应用

了解了色谱分析的

基本原理以及定性定量方法

其实这些基本理论、

定性定量方法

同样适用于液相色谱

液相色谱和气相色谱

也存在较明显的差别

最直观的差别

就是气相色谱以气体为流动相

气体只作为载气

改善色谱分离只依靠固定相

主要用于气体、

易挥发和热稳定性好的

物质的分离分析

而液相色谱以液体为流动相

除了要选择合适的固定相外

还需要通过改变流动相的

性质和比例来改变分配比

进而改善色谱分离

适用于各种沸点高、

极性强、热稳定性差

但能溶于溶剂的物质

估计约80%有机物

可采用液相色谱进行分析

两者的主要差别如表所示

三、高效液相色谱仪

与气相色谱仪类似

包括高压输液系统、

进样系统、分离系统、

检测系统等

主要品牌国外的

主要有waters、Agilent、岛津等

国产品牌大连依利特、北分瑞利、

上海天美等也得到了快速发展

四、高效液相色谱仪主要部件

1. 高压输液系统：

包括贮液罐、高压输液泵、

梯度洗脱装置等

（1）贮液罐

一般为玻璃瓶

也有用耐腐蚀的不锈钢、

氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)

特种塑料制成的容器

储液瓶位置要高于泵体

以保持一定的输液静压差

在泵启动时易于

让残留在溶剂

和泵体中的微量气体

通过放空阀排出

（2）高压输液泵

其作用是将流动相

以稳定的流速或压力输送

到色谱系统

流动相的稳定性直接关系到

分析结果的重复性和准确性

要求：流量恒定，无脉动

抗溶剂腐蚀

有较高的输液压力

一般要求达到150~400个大气压

常用类型有：往复柱塞泵、

气动放大泵、螺旋注射泵

往复柱塞泵

是使用最广泛的恒流泵

气动放大泵

以低压气体作用在

大面积气缸活塞上

传递到小面积液缸活塞

利用压力放大获得高压

螺旋注射泵使用较少

（3）梯度洗脱装置

梯度洗脱

就是流动相中含有两种（或更多）

不同极性的溶剂

在分离过程中按一定程序

连续改变溶剂配比和极性

从而实现复杂样品的良好分离

对复杂样品的分离

气相色谱采用程序升温的方法

液相色谱采用梯度洗脱的方法

液相色谱的梯度洗脱有2种实现方式

一是高压梯度，利用两台高压泵

将两种不同极性的溶剂

按设定比例送入混合室

混合后再送入色谱柱

二是低压梯度

先将两种或多种不同极性的

溶剂按一定程序混合后

再用一台高压泵输入色谱柱

2. 进样系统：

作用是将待分析样品引入色谱柱

包括手动和自动进样器两种

（1）手动进样：

通常采用耐高压的六通进样阀

其结构如图所示

（2）自动进样器：

一种智能化、自动化的进样仪器

只需设置好进样参数、

放入待检测样品即可完成自动进样过程

3. 分离系统

色谱柱是色谱分离的核心

要求柱效高、性能稳定

通常柱体为不锈钢管

长5～40cm，按内径大小可分为

常规分析柱、窄径柱、

毛细管柱、制备柱、半制备柱等

减小填料粒度及柱径和柱长

提高柱效和分析速度是发展趋势

有时会在分析柱前

装一根较短的保护柱

填料与分离柱完全一样

可以防止来自流动相

和样品中的不溶性微粒

对分析柱的堵塞

还可以除去样品中

能与固定相不可逆结合的物质

以保护分析柱，延长使用寿命

需要注意的是

清洗保护柱时要拆下分析柱

以免洗脱物进入污染分析柱

4. 检测系统：

其作用是将流经样品池的

液体试样的质量或浓度信号

转变为电信号

常用的有以下几种：

（1）紫外检测器UVD：

应用最广泛

对大部分有机化合物有响应

特点是：

灵敏度高、对流动相的流速

和温度变化不敏感、波长可选

可用于梯度洗脱

（2）二极管阵列检测器 DAD

用1024个二极管阵列同时

检测透过样品的所有波长

通过计算机快速处理

获得组分的吸收光谱

得到吸光度——波长——时间

三维立体谱图

由三维谱图可以获得

特定组分的结构信息

也可进行峰纯度的检查

有助于未知组分

或复杂组分的结构确定

如图所示

DAD的特点：

① 选择波长使色谱中

每种组分都有最佳灵敏度和分离度

② 可以选择适当波长消除干扰

③ 以在线方式对色谱峰进行光谱扫描

④ 利用(A-λ–t)三维谱图对照定性

可以提高保留时间tR定性的准确度

特别是随着化学计量学的发展

将色谱与光谱等信息有效结合

能够解决重叠峰的识别

和定量计算难题

检测出隐蔽的杂质

因此，普遍认为DAD

将是液相色谱中

最有发展前景的检测器

对于单纯的含量分析

常规UVD检测器即可

（3）荧光检测器FD：

含有共轭π键体系的芳环

或杂环有机物

及其金属离子配合物等

受紫外光激发后

能发射出比激发光波长长的荧光

适合各种维生素、叶绿素、

氨基酸和蛋白质、酶、辅酶

以及各种药物、毒物和农药等

尤其适于生物体组分的分析

对于部分没有荧光的物质

可以通过与能发荧光的

物质衍生化后进行检测

荧光检测器具有灵敏度高、

选择性好等特点

（4）示差折光检测器RID：

UVD之外应用最多的通用型检测器

利用连续测定参比池中的

纯溶剂与样品池中的洗脱液

与组分混合液折射率的变化

来测量样品浓度

依据差值与浓度呈正比进行定量分析

适用于分析无紫外吸收的有机物

如高分子化合物、糖类、

脂肪烷烃等

也是凝胶色谱的必备检测器

制备色谱中也经常使用

但是灵敏度较低

由于折射率对温度

和流速比较敏感

检测器需要恒温

不能用于梯度洗脱

（5）蒸发光散射检测器 ELSD

色谱柱流出液进入雾化器

在氮气或空气流作用下形成微小雾滴

在加热漂移管中，溶剂蒸发

溶质形成细小颗粒

激光束照射下发生光散射

散射光的强度

取决于溶质颗粒的数量

即组分浓度

特点有：

① 可检测挥发性

低于流动相的任何样品

② 流动相低温雾化和蒸发

对热不稳定和挥发性物质

也有较高的灵敏度

③ 无溶剂峰干扰

对温度变化不敏感

适合梯度洗脱

④ 通用型检测器

可与任何HPLC系统连接

⑤ 使用不便，需要配置

高压氮气或空气

实验中产生的废气有一定的毒害

广泛应用于不含

发色团化合物的检测

如碳水化合物、脂类、聚合物、

未衍生脂肪酸和氨基酸、

表面活性剂、药物等

适合于在没有标准品

和化合物结构参数未知的

情况下检测未知化合物

这里列举了ELSD

与几种常用检测器之间的对比

可以作为选择参考

（6）电化学检测器

基于电化学原理和物质的

电化学性质进行检测

有安培、极谱及电导等类型

适用于测定具有电化学氧化还原性质

及电导的化合物

如含硝基、氨基等有机化合物

及无机阴、阳离子等

电导检测器是离子色谱法中

使用最广泛的检测器

5. 信号处理与显示系统

主要作用是对

检测器的信号进行放大、

记录与数据处理

并显示测定结果

目前基本都配有色谱工作站

通过计算机对色谱分析数据

进行自动处理

有的还能直接控制仪器部件

6. 辅助系统

（1）柱温箱

精确、稳定的控制色谱柱的使用温度

但HPLC分析大多在室温

需要精确控制的

通常控温在20-60℃左右

所以对HPLC影响不大

（2）脱气装置

流动相脱气有利于：

高压泵准确输液

提高保留时间及

色谱峰面积的重现性

提高检测性能

防止流动相中气泡引起的尖峰

和降低溶剂本底对基线的影响

保护色谱柱

防止气泡中氧等对柱填料的氧化等

脱气方式主要有：

超声脱气：

一般能除去30%左右的溶解气体

当溶剂中的气体浓度比较低的时候

还可能增加溶解量

因此，与真空脱气结合使用比较好

真空脱气：

一种在负压状态下减少溶剂中

气体溶解的方法

减压过滤：实验室二次脱气

处理常采用的有效方法

在线脱气：在输液泵前对流动相

进行连续脱气的装置

需要配置设备

工作原理大多数是真空脱气

好了，今天我们了解了

液相色谱法的特点以及

与气相色谱法的区别

重点介绍了液相色谱仪的

主要部件及其工作原理

为运用液相色谱奠定了基础

下次课我们介绍

液相色谱分离的主要类型及其原理

了解液相色谱分离背后的机理

下次课见