当前课程知识点：分子生物学 > 第三章 细胞凋亡的分子机制 > 第4节 细胞凋亡的检测 > 细胞凋亡的检测
大家好
我是来自中南大学湘雅三医院的闾宏伟
这堂课我们学习细胞凋亡的检测
在细胞凋亡的研究中
我们经常需要确定细胞是否发生了凋亡
下面我们介绍几种常用的细胞凋亡检测的方法
包括磷脂酰丝氨酸外翻分析
流式细胞检测 DNA片段化检测
TUNEL法以及Caspase-3活性检测
首先我们介绍磷脂酰丝氨酸外翻分析
也称为Annexin V分析法
磷脂酰丝氨酸正常是位于细胞膜的内侧
在凋亡早期的时候会从细胞膜的内侧
外翻到细胞膜的表面
Annexin V是
钙离子依赖性磷脂结合蛋白
它能够与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性的结合
因此Annexin V
是检测细胞早期凋亡的一个灵敏的指标
这是Annexin V
检测细胞凋亡的一个示意图
当细胞发生凋亡时
磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到膜的表面
Annexin V可以与
磷脂酰丝氨酸特异性的结合
Annexin V会带有一个荧光素FITC
通过荧光显微镜可以检测到这个凋亡的细胞
像这个荧光信号很强的
就是代表凋亡的细胞
那么接下来我们介绍流式细胞仪
检测细胞凋亡的方法
主要有两种检测的手段
第一个是检测细胞周期的DNA含量
在这个2倍里的前面会出现一个峰
特别是这个实验组这个峰很明显
那么这个峰就代表细胞凋亡
流式细胞检测还有另外一个方法
而我们更加推荐使用的是下面这种方法
它是通过荧光素标记的
Annexin V和PI也就是碘化丙啶
对细胞进行双染色
采用流式细胞仪检测
它可以将早期的凋亡细胞
活细胞和坏死细胞
或者是晚期凋亡的细胞来区分开
Annexin V是能与凋亡细胞膜上的
磷脂酰丝氨酸特异性结合
而PI是一种可以嵌入到
DNA双链的一个红色荧光物质
它不能通过完整的细胞膜
对活细胞和早期凋亡的细胞
它是不能够染色的
但是它可以进入坏死的细胞
或者说晚期的凋亡细胞
如图所示
Annexin V染色阳性的这个区
它是代表早期凋亡的细胞
而PI染色这个区
它是代表晚期凋亡的细胞或者是坏死的细胞
两个颜色都没染的这个细胞
它是代表活细胞
所以我们在流式细胞检测的时候
可以看到三个象限里头
这一个象限它是代表活细胞
这个象限它代表是早期凋亡的细胞
这个象限它代表是晚期凋亡细胞和坏死的细胞
第三个检测方法是DNA片段化分析
细胞凋亡时 染色体DNA
在核小体单位之间的连接处会断裂
形成大约200 bp左右的
整倍数的寡核苷酸片段
在凝胶电泳的时候
会表现出一个梯形的电泳图谱
也叫做DNA ladder
那么从这个图上我们可以看出
核小体是由DNA和组蛋白来形成的一个
染色质的一个基本结构单位
每个核小体是由146 bp的DNA
缠绕组蛋白八聚体
近两圈左右来形成的
核小体之间是有60 bp的一个
连接的DNA
细胞发生凋亡的时候
核酸内切酶是在核小体之间的一个连接处
来切割DNA
形成一个约200左右的
整数倍的寡核苷酸一个片段
这个是我们凝胶电泳的一个示意图
第一条带是代表一个Marker
这个是阴性对照
第三条带是代表
凋亡的细胞的电泳图谱
第四种方法是可以采用TUNEL法
来检测细胞凋亡
TUNEL法检测细胞凋亡的原理是
基因组DNA断裂的时候
它会暴露出3'的羟基
可以在末端脱氧核苷酸转移酶TdT
它的作用下
可以加上
带有这个荧光素FITC标记的dUTP
从而可以通过荧光显微镜来检测到
这就是TUNEL法
检测细胞凋亡的一个操作示意图
贴壁细胞或者是细胞涂片
在这个样品上面再加入
TUNEL的一个检测试剂
包括末端脱氧核苷酸转移酶
和带有荧光素FITC标记地dUTP
然后在37度孵育 用封片液
封片以后在荧光显微镜下进行观察
我们可以看到凋亡的细胞是发绿色荧光的
像这个绿色荧光很强的都是代表凋亡的细胞
最后我们介绍
通过Caspase活性来检测
判断细胞的凋亡
Caspase活性检测的原理
它是基于Caspase-3可以催化这个底物
AC-DEVD-pNA这是一个化学物
它可以产生黄色的对硝基苯胺PNA
通过测定吸光度来检测这个细胞液
是不是含有Caspase-3的酶的活性
从这个图上我们可以看出
先将Caspase-3的抗体
包被在固体基质上面
然后加入检测样品
比如细胞裂解液
孵育以后随后加入催化底物
AC-DEVD-pNA
它在Caspase-3的作用下
它会将底物分解产生黄色的对硝基苯胺
通过测定吸光度来检测
细胞是否发生了凋亡
Caspase的活性检测还可以通过
Western blot来分析来进行
它的原理主要是PARP
是Caspase-3的一个底物
PARP水解可以形成
相对分子量为85KD和31KD的两个片段
采用Western blot
来检测细胞是否发生凋亡
这个示意图我们可以看出来
一旦检测到了这有85KD的片段的出现
就代表样品中的Caspase-3
这个酶被激活
这堂课我们就介绍到这里
-第1节 分子生物学的定义
--分子生物学的定义
-第2节 分子生物学的主要研究内容
-第3节 分子生物学发展简史与学习方法
-第一章 测试
-第一章 课件
--第一章 课件
-第1节 染色体
--染色体
-第2节 染色体病与染色体畸变
-第3节 常染色体病
--常染色体病
-第4节 性染色体病
--性染色体病
-第二章 测试
-第二章 课件
--第二章 课件
-第1节 细胞凋亡概述
--细胞凋亡概述
-第2节 细胞凋亡的分子机制
-第3节 细胞凋亡与疾病
--细胞凋亡与疾病
-第4节 细胞凋亡的检测
--细胞凋亡的检测
-第三章 测试
-第三章 课件
--第三章 课件
-第1节 单基因病的概念
--单基因病的概念
-第2节 常染色体显性/隐性遗传病
-第3节 X连锁显性/隐性遗传病
-第4节 Y连锁遗传病
--Y连锁遗传病
-第四章 测试
-第四章 课件
--第四章 课件
-第1节 基因的概念和组构
--基因的概念和组构
-第2节 基因分型
--基因分型
-第3节 基因组
--基因组
-第五章 测试
-第五章 课件
--第五章 课件
-第1节 基因结构与功能的生物信息学分析原理
-第2节 基因启动子及调控序列的结构分析方法
-第3节 基因编码区结构分析方法
-第4节 基因功能分析方法
--基因功能分析方法
-第六章 测试
-第六章 课件
--第六章 课件
-第1节 DNA甲基化与基因表达的表观遗传调控
-第2节 组蛋白修饰与基因表达的表观遗传调控
-第3节 染色质重塑与基因表达的表观遗传调控
-第七章 测试
-第七章 课件
--第七章 课件
-第1节 基因治疗的策略
--基因治疗的策略
-第2节 基因转移技术
--基因转移技术
-第3节 基因干预
--基因干预
-第4节 基因治疗的应用研究
-第八章 测试
-第八章 课件
--第八章 课件
-第1节 蛋白质分子的折叠
--蛋白质分子的折叠
-第2节 蛋白质分子的定位
--蛋白质分子的定位
-第3节 蛋白质的修饰
--蛋白质的修饰
-第4节 蛋白质的降解
--蛋白质的降解
-第九章 测试
-第九章 课件
--第九章 课件
-第1节 长链非编码RNA
--长链非编码RNA
-第十章 测试
-第十章 课件
--第十章 课件
-第1节 基因组学
--基因组学
-第2节 转录组学
--转录组学
-第3节 蛋白质组学
--蛋白质组学
-第4节 其他组学
--其他组学
-第十一章 测试
-第十一章 课件
--第十一章 课件
-第1节 PCR技术概述
--PCR技术概述
-第2节 PCR实验要点
--PCR实验要点
-第3节 PCR的应用及其衍生技术
-第十二章 测试
-第十二章 课件
--第十二章 课件
-第1节 蛋白质印迹概述
--蛋白质印迹概述
-第2节 蛋白质印迹实验流程
-第3节 蛋白质印迹常见问题分析
-第十三章 测试
-第十三章 课件
--第十三章 课件
-第1节 神经示踪的定义、用途、原理
-第2节 示踪剂的要求和分类
-第3节 神经示踪的应用
--神经示踪的应用
-第十四章 测试
-第十四章 课件
--第十四章 课件
-第1节 遗传修饰动物概述及应用
-第2节 动物遗传修饰策略
--动物遗传修饰策略
-第3节 遗传修饰常用技术
-- 遗传修饰常用技术
-第4节 动物遗传修饰实验方法
-- 动物遗传修饰实验方法
-第十五章 测试
-第十五章 课件
--第十五章 课件
