当前课程知识点：分子生物学 > 第十二章 聚合酶链式反应 > 第3节 PCR的应用及其衍生技术 > PCR的应用及其衍生技术
同学们好
我是来自中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我们讲的这个知识点是
PCR的应用及其衍生技术
PCR技术在生物医学领域应用极为广泛
它可以检测及获得目的基因
PCR检测灵敏度极高
理论上只要有一个分子便可扩增检测出来
得到目的片段后
可进行进一步测序克隆和基因功能分析
它也可以做定点突变
将右边的信息涉及到引物中
通过PCR就可以使靶序列发生定点的突变
这样的话就引入了点突变插入或者是缺失突变
用于研究基因的功能及表达调控
在一个PCR可以检测基因表达
利用定量或荧光实时定量
可检测目的基因的表达水平
基因组测序
目前基因组测序用得非常广泛
对某种生物进行基因组测序会出现一些缺口
利用反向PCR和锚定PCR
这样一些特殊的衍生技术可以填补这些缺口
另外不对称PCR和乳液PCR的扩增产物
为单链DNA时可直接做测序的模板
PCR衍生技术
比如说序列特异性寡核苷酸多态性PCR
就是PCR-SSCP
常用于对人类白细胞抗原进行分型
可供供受体进行提供准确配型
提高器官移植的成功性
可以用于基因诊断
广泛用于遗传病肿瘤和传染性疾病的筛查
法医学和流行病学方面也有广泛的应用
可用于个体识别亲子鉴定
确定致病微生物和传染源
从而确定传播途径控制疾病的发生
我们看一些衍生的技术
反转录PCR就是RTP下
是将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术
在反转录酶的作用下
以mRNA为模板反转录形成cDNA为模板
进行PCR扩增
可将低丰度的mRNA扩增用于检测和功能研究
可对基因的转录产物进行分析
获得目的基因
合成cDNA探针以及构建RNA高效转录系统
反转录PCR酶的选择
第一种是猴子里面的鼠白血病病毒反转录酶
有较强的聚合酶特性
RNA酶H活性相对比较弱势适合温度37度
然后其他的一些聚合酶根据所需要的条件
进行适当的选择
反转录PCR引物的选择
反转录过程中我们可能用到随机引物
适合于长的或具有发卡结构的RNA
适合于RNA mRNA tPNA
所有的RNA的反转录反应
主要应用于单一模板的RT反应
第二个就是Oligo dT引物
主要适用于有PolyA尾巴的RNA
原核生物的RNA真核生物的Oligo dT
rRNA tRNA不具有PolyA的尾巴
这个是应用不了的
由于Oligo dT可以结合到
mRNA的PolyA尾巴上
所以对RNA的样品质量要求比较高
即使有少量降解也会使全长cDNA的含量减少
再一个就是特异性的引物
是与模板序列相互互补的引物
适用于目的序列的已知
目前的话实时荧光定量PCR比较常用
它有两种主要的方法
一种是荧光染料法也称DNA结合染色法
是RT-qPCR最早使用的方法
DNA结合染料与双链DNA结合时
在激发光作用下发出荧光
荧光信号的强弱与双链DNA分子的数量成正比
可以对样品进行定量
常用的染料是SYBR Green这种方法最常用
它价格相对便宜
但是定量的准确性比荧光探针法要低
荧光探针法是基于荧光共振能量转移
建立的一种定量方法
包括水解探针法 分子信标法等
水解探针法也称外切核酸酶探针法
以TaqMan探针为代表
分子信标法是利用荧光共振能量转移现象
建立起来的一种新型荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR
可以实现PCR从定性到定量的飞跃
这种方法不需要电泳通过荧光信号的积累
直接观测到整个PCR反应过程
巢式PCR的应用是DNA模板的拷贝数太低
或者特异性不高
可采用巢式PCR
另外就是多重PCR要注意各对引物扩增时
DNA片段长短有差异
以便通过电泳检测区分
反向PCR是对已知DNA片段两侧未知序列
进行扩增和研究的一种特殊PCR方法
限制性酶切割样品DNA时
利用连接酶将酶切产物连接环化
在已知序列内设计一对方向相反的引物
以自身环化的DNA为模板进行PCR
以扩增未知的区域
主要用于获得启动子序列 定点诱变
在表达载体中引入便签肽段的编码序列
鉴定插入失活基因等
原位PCR将PCR与可进行细胞定位的
原位杂交技术相结合的一种方法
就是在组织切片或细胞涂片的单个细胞内进行PCR
使靶序列拷贝数扩增
在用特异性探针进行原位杂交
对靶序列进行定性定量和定位分析
它可检测DNA和RNA
菌落PCR就是不必提取基因组DNA和酶切鉴定
直接从菌体热解后暴露的DNA为模板
进行PCR扩增 省时省力
比如说我们挑克隆的时候
就直接分离这个菌落进行PCR
PCR单链构象多态这是一种将PCR技术
与单链构象多态性结合的DNA技术
先将样品PCR扩增 变性
然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
不同构象的等长链DNA电泳迁移率不一样
可将不同的分子区分
应用这种技术单个碱基的变异也能检测
PCR限制性片段长度多态
是用特定的限制性内切酶切割DNA序列
释放的片段大小与正常的基因相比
是有明显的差异
通过电泳检测分析目的基因的多态性
主要用于基因突变和等位基因多态性分析
这个知识点我们就讲到这里
谢谢大家
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