基因转移技术在线视频

同学们好

我是来自

中南大学生命科学学院的曾赵军老师

这一讲我们讲基因转移技术

基因转移

它有两种方式

第一种方式就是ex vivo晶活体

它是指

将目的基因通过载体导入到靶细胞当中

然后再将这些靶细胞

重新回输到患者的体内

这样一个过程我们就叫做ex vivo

第二种途径

是in vivo

它是指将目的基因直接输入体内

基因转移技术

根据它所依赖的介质

可以分为病毒介导的基因转移系统

病毒载体介导的基因转移系统效率较高

是使用最多的基因治疗的载体

其中用的最多的是逆转录病毒

下面我们就一起来看一下

逆转录病毒

逆转录病毒

它的结构大致如下

我们以人类免疫缺陷病毒HIV为例

它的细胞核心类是RNA链

在感染颗粒的外面

它是膜蛋白

里面有一些核心蛋白和逆转录酶等等

下面我们通过这个动画

我们可以看看逆转录病毒的复制和感染

病毒的复制（或生活周期）

逆转录病毒颗粒

通过外膜蛋白接触细胞表面受体

使病毒附着于敏感细胞的表面

发生特异性吸附

接着病毒与细胞膜融合

病毒核衣壳穿入细胞

进入胞浆发生脱壳

当逆病毒进入宿主细胞后

以RNA为模板

在依赖RNA的DNA多聚酶

和tRNA引物的作用下

合成负链DNA

正链RNA被降解

进而以负链DNA为模板

形成双股DNA

转入细胞核内

随机整合至宿主

细胞基因组DNA中

成为前病毒

前病毒DNA转录出病毒mRNA

翻译出病毒蛋白质及合成包装蛋白

将转录的病毒RNA基因组包装装配后

以出芽方式释放分泌至细胞外

完成一个完全的生活周期

RNA病毒感染后约6个小时

一个细胞可产生

多达10,000个病毒颗粒

逆转录病毒前病毒的结构特点是什么

下面我们看这一张模式图

从这张图中我们可以看到

逆转录病毒前病毒

它的两端各有长末端重复序列

LTR的这样一个结构

这个LTR它是病毒整合

到宿主细胞基因组当中的

一个关键性的结构

在LTR里面

它有U3 R和U5三部分组成

而且U3类有增强子和启动子

在U3和U5的两端有病毒整合的序列

以及在R内还有poly(A)加尾的信号

在逆转录病毒前病毒

它的结构特点里面

它有三个结构基因

分别是gag pol和env

在五撇端LTR的下游

有一段病毒包装所必需的信号系列

我们称之为Ψ-packaging signal

同时还有剪接供体位点

sd和简洁受体位点SA等等

逆转入病毒介导的基因转移系统

在实际应用当中它有两部分组成

第一部分是逆转录病毒的载体

载体的部分

这个载体的部分

它保留了病毒颗粒的包装信号

但是它缺少了病毒颗粒包装蛋白的基因

因此它可以克隆并表达外源的基因

也就是靶基因

但是它不能够自我包装

包装成有增值能力的病毒颗粒

逆转录病毒介导的

基因转移系统的第二个部分

它是一个辅助细胞株

这个辅助细胞株

它是由另外一种缺陷型的逆转录病毒

感染构建而成

在这个细胞株里面

它能够合成包装蛋白

用于逆转录病毒的包装

但是它本身由于缺乏包装的信号

所以它自身是不能够

被包装成一个病毒的颗粒的

只有将这两者相结合

也就是说逆转录病毒的载体部分

和辅助细胞株两者相互结合

它才能够产生有复制能力的

逆转录病毒的感染的颗粒

这个感染的颗粒

就是我们用于基因治疗的

最终的一个产物

下面我们看看

逆转录病毒载体的特点

逆转录病毒载体

它的结构基因

gag env和pol的部分缺失

并不影响到其它部分的活性

第二

包装好的

病毒颗粒是易于分离制备

第三

逆转录病毒

它所携带的遗传物质

可以高效地进入到靶细胞当中

第四点就是前病毒

它可以通过LTR高效的整合至

靶细胞的基因组当中

有利于基因

在靶细胞中的永久的表达

逆转录病毒载体的主要缺点有哪一些

主要的缺点就是它是随机整合

因此它有插入突变

激活癌基因的潜在的危险

第二点就是逆转录病毒载体

它的容量较小

只能容纳7个kb以下的外源基因

下面我们介绍腺病毒AV载体

腺病毒它是一种大分子

36KB双链无包膜的DNA病毒

它通过受体介导的内吞作用进入到细胞内

然后腺病毒基因转移到细胞核内

并保持在染色体外

它是不整合进入宿主细胞的基因组当中的

这是一个腺病毒的一个模式图

它是一个双链无包膜的双链DNA病毒

腺病毒载体的优点有哪一些

我们可以看到腺病毒载体

它基因导入的效率比较高

宿主的范围广

基因转导与细胞的分裂无关

并且它可以通过口服经肠道吸入

或者是喷雾吸入

或者是气管内滴注

这种便于临床操作的方式进行

另外一个优点就是它的容量比较大

它可以插入7.5KB的外源的基因

现病毒载体的缺点又有哪些

第一个缺点

它不能整合到靶细胞的基因组DNA当中

所以基因表达的时间比较短暂

第二个在有些人体当中

它可能因为宿主的免疫反应

导致腺病毒载体表达短暂

第三个

在它的两个环节当中

有可能产生复制型的腺病毒

最后一个缺点就是它的靶向性比较差

这个表格当中列举了我们常用的基因治疗载体

它的一些整合的特点

安全性和感染的细胞

以及克隆的容量

我们在做基因治疗的时候

根据每一种病毒载体

它的自身的特点来进行选择

下面我们介绍

非病毒载体介导的基因转移系统

首先我们来看一下

脂质体介导的基因转移技术

脂质体介导的基因转移技术

它是利用阳离子脂质体与DNA混合以后

自动形成包埋外源DNA的脂质体

然后与细胞一起孵育

即可通过细胞的内吞作用

将这些外源的DNA

含有目的的基因转移到细胞内

在细胞内进行表达

我们可以看看这个示意图

这是质粒DNA

它表面是带负电荷的

当它和阳离子的脂质体进行混合的时候

它可以形成DNA

和阳离子脂质体的一个复合物

这个复合物和细胞一起孵育

它就可以被细胞所吞隐

在细胞内进行基因的表达

下面我们介绍受体介导的转移技术

受体介导的转移技术

它是指将DNA与细胞

或者是组织亲和性的配体进行偶联

可使DNA它的导入具有靶向性

我们可以看到

这里是质粒的DNA

它表面是带负电荷的

当我们通过polylysine

多聚赖氨酸

和转铁蛋白进行偶联以后

在一定条件下进行孵育

它可以形成包裹

这个质粒DNA的这样一个复合物

这个复合物通过和肝细胞在一起孵育

它能够被肝细胞表面的一些受体

这个受体就是转铁蛋白的一个受体

能够通过受体和配体的偶联进行结合

结合以后它就能够

被肝细胞所吞隐

在肝细胞内Nucleus和Lysosome

也就是溶酶体和胞内体进行溶解一部分

其余的一部分

就会进入到肝细胞的细胞核内

进行基因的表达

这个就是通过

受体介导的基因转移的技术

下面我们介绍另外一种

基因直接注射的技术

这种技术经典的代表有

肌内注射凝血因子九基因

它可以产生血友病

所需要的凝血因子九

从而达到治疗血友病的目的

这一节课的知识点我们就讲到这里

谢谢大家