当前课程知识点：分子生物学 > 第八章 基因治疗 > 第2节 基因转移技术 > 基因转移技术
同学们好
我是来自
中南大学生命科学学院的曾赵军老师
这一讲我们讲基因转移技术
基因转移
它有两种方式
第一种方式就是ex vivo晶活体
它是指
将目的基因通过载体导入到靶细胞当中
然后再将这些靶细胞
重新回输到患者的体内
这样一个过程我们就叫做ex vivo
第二种途径
是in vivo
它是指将目的基因直接输入体内
基因转移技术
根据它所依赖的介质
可以分为病毒介导的基因转移系统
病毒载体介导的基因转移系统效率较高
是使用最多的基因治疗的载体
其中用的最多的是逆转录病毒
下面我们就一起来看一下
逆转录病毒
逆转录病毒
它的结构大致如下
我们以人类免疫缺陷病毒HIV为例
它的细胞核心类是RNA链
在感染颗粒的外面
它是膜蛋白
里面有一些核心蛋白和逆转录酶等等
下面我们通过这个动画
我们可以看看逆转录病毒的复制和感染
病毒的复制（或生活周期）
逆转录病毒颗粒
通过外膜蛋白接触细胞表面受体
使病毒附着于敏感细胞的表面
发生特异性吸附
接着病毒与细胞膜融合
病毒核衣壳穿入细胞
进入胞浆发生脱壳
当逆病毒进入宿主细胞后
以RNA为模板
在依赖RNA的DNA多聚酶
和tRNA引物的作用下
合成负链DNA
正链RNA被降解
进而以负链DNA为模板
形成双股DNA
转入细胞核内
随机整合至宿主
细胞基因组DNA中
成为前病毒
前病毒DNA转录出病毒mRNA
翻译出病毒蛋白质及合成包装蛋白
将转录的病毒RNA基因组包装装配后
以出芽方式释放分泌至细胞外
完成一个完全的生活周期
RNA病毒感染后约6个小时
一个细胞可产生
多达10,000个病毒颗粒
逆转录病毒前病毒的结构特点是什么
下面我们看这一张模式图
从这张图中我们可以看到
逆转录病毒前病毒
它的两端各有长末端重复序列
LTR的这样一个结构
这个LTR它是病毒整合
到宿主细胞基因组当中的
一个关键性的结构
在LTR里面
它有U3 R和U5三部分组成
而且U3类有增强子和启动子
在U3和U5的两端有病毒整合的序列
以及在R内还有poly(A)加尾的信号
在逆转录病毒前病毒
它的结构特点里面
它有三个结构基因
分别是gag pol和env
在五撇端LTR的下游
有一段病毒包装所必需的信号系列
我们称之为Ψ-packaging signal
同时还有剪接供体位点
sd和简洁受体位点SA等等
逆转入病毒介导的基因转移系统
在实际应用当中它有两部分组成
第一部分是逆转录病毒的载体
载体的部分
这个载体的部分
它保留了病毒颗粒的包装信号
但是它缺少了病毒颗粒包装蛋白的基因
因此它可以克隆并表达外源的基因
也就是靶基因
但是它不能够自我包装
包装成有增值能力的病毒颗粒
逆转录病毒介导的
基因转移系统的第二个部分
它是一个辅助细胞株
这个辅助细胞株
它是由另外一种缺陷型的逆转录病毒
感染构建而成
在这个细胞株里面
它能够合成包装蛋白
用于逆转录病毒的包装
但是它本身由于缺乏包装的信号
所以它自身是不能够
被包装成一个病毒的颗粒的
只有将这两者相结合
也就是说逆转录病毒的载体部分
和辅助细胞株两者相互结合
它才能够产生有复制能力的
逆转录病毒的感染的颗粒
这个感染的颗粒
就是我们用于基因治疗的
最终的一个产物
下面我们看看
逆转录病毒载体的特点
逆转录病毒载体
它的结构基因
gag env和pol的部分缺失
并不影响到其它部分的活性
第二
包装好的
病毒颗粒是易于分离制备
第三
逆转录病毒
它所携带的遗传物质
可以高效地进入到靶细胞当中
第四点就是前病毒
它可以通过LTR高效的整合至
靶细胞的基因组当中
有利于基因
在靶细胞中的永久的表达
逆转录病毒载体的主要缺点有哪一些
主要的缺点就是它是随机整合
因此它有插入突变
激活癌基因的潜在的危险
第二点就是逆转录病毒载体
它的容量较小
只能容纳7个kb以下的外源基因
下面我们介绍腺病毒AV载体
腺病毒它是一种大分子
36KB双链无包膜的DNA病毒
它通过受体介导的内吞作用进入到细胞内
然后腺病毒基因转移到细胞核内
并保持在染色体外
它是不整合进入宿主细胞的基因组当中的
这是一个腺病毒的一个模式图
它是一个双链无包膜的双链DNA病毒
腺病毒载体的优点有哪一些
我们可以看到腺病毒载体
它基因导入的效率比较高
宿主的范围广
基因转导与细胞的分裂无关
并且它可以通过口服经肠道吸入
或者是喷雾吸入
或者是气管内滴注
这种便于临床操作的方式进行
另外一个优点就是它的容量比较大
它可以插入7.5KB的外源的基因
现病毒载体的缺点又有哪些
第一个缺点
它不能整合到靶细胞的基因组DNA当中
所以基因表达的时间比较短暂
第二个在有些人体当中
它可能因为宿主的免疫反应
导致腺病毒载体表达短暂
第三个
在它的两个环节当中
有可能产生复制型的腺病毒
最后一个缺点就是它的靶向性比较差
这个表格当中列举了我们常用的基因治疗载体
它的一些整合的特点
安全性和感染的细胞
以及克隆的容量
我们在做基因治疗的时候
根据每一种病毒载体
它的自身的特点来进行选择
下面我们介绍
非病毒载体介导的基因转移系统
首先我们来看一下
脂质体介导的基因转移技术
脂质体介导的基因转移技术
它是利用阳离子脂质体与DNA混合以后
自动形成包埋外源DNA的脂质体
然后与细胞一起孵育
即可通过细胞的内吞作用
将这些外源的DNA
含有目的的基因转移到细胞内
在细胞内进行表达
我们可以看看这个示意图
这是质粒DNA
它表面是带负电荷的
当它和阳离子的脂质体进行混合的时候
它可以形成DNA
和阳离子脂质体的一个复合物
这个复合物和细胞一起孵育
它就可以被细胞所吞隐
在细胞内进行基因的表达
下面我们介绍受体介导的转移技术
受体介导的转移技术
它是指将DNA与细胞
或者是组织亲和性的配体进行偶联
可使DNA它的导入具有靶向性
我们可以看到
这里是质粒的DNA
它表面是带负电荷的
当我们通过polylysine
多聚赖氨酸
和转铁蛋白进行偶联以后
在一定条件下进行孵育
它可以形成包裹
这个质粒DNA的这样一个复合物
这个复合物通过和肝细胞在一起孵育
它能够被肝细胞表面的一些受体
这个受体就是转铁蛋白的一个受体
能够通过受体和配体的偶联进行结合
结合以后它就能够
被肝细胞所吞隐
在肝细胞内Nucleus和Lysosome
也就是溶酶体和胞内体进行溶解一部分
其余的一部分
就会进入到肝细胞的细胞核内
进行基因的表达
这个就是通过
受体介导的基因转移的技术
下面我们介绍另外一种
基因直接注射的技术
这种技术经典的代表有
肌内注射凝血因子九基因
它可以产生血友病
所需要的凝血因子九
从而达到治疗血友病的目的
这一节课的知识点我们就讲到这里
谢谢大家
-第1节 分子生物学的定义
--分子生物学的定义
-第2节 分子生物学的主要研究内容
-第3节 分子生物学发展简史与学习方法
-第一章 测试
-第一章 课件
--第一章 课件
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--性染色体病
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-第1节 细胞凋亡概述
--细胞凋亡概述
-第2节 细胞凋亡的分子机制
-第3节 细胞凋亡与疾病
--细胞凋亡与疾病
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