当前课程知识点：分子生物学 > 第十二章 聚合酶链式反应 > 第1节 PCR技术概述 > PCR技术概述
同学们好
我是来自中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我们介绍的这个知识点是
聚合酶链式反应的概述
聚合酶链式反应是一种用于
放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术
它可以看作生物体外的特殊DNA复制
其最大特点就是
将微量的DNA大幅度的扩增
具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好
和易自动化等突出优点
可用于基因分离 克隆
和核酸序列分析等基础研究
为什么我们花大篇幅讲这个PCR技术呢
这个技术应用的太广了
所以我们的课程是花了大篇幅的
首先我们回顾一下PCR技术的简史
20世纪60年代末70年代初
人们致力研究基因的体外分离技术
但是核酸含量较少
一定程度上限制了DNA的体外操作
就现在而言
是很大程度上限制了DNA的一些操作
然后Khorana
1971年首先提出了核酸体外扩增的设想
他说核酸能不能在体外扩充一下呢
但是当时的基因序列分析方法尚未成熟
热稳定的DNA聚合酶还未被发现
我觉得这个是一个限制性的步骤
寡核苷酸引物合成还处于手工/半自动合成阶段
想法似乎没有任何实际意义
1985年Kary Mullis在一个企业工作期间
经过两年的努力 发明了PCR技术
在Science杂志上面发表了
关于PCR技术的第一篇论文
因为这个（发明）
他获得了1993年的诺贝尔化学奖
Mullis博士在发明PCR技术后
曾这样描述 用一个单分子的DNA
PCR能在一个下午内产生
100百万个相似的分子
也就是说一亿个分子
反应很容易进行
只需要一个小管子 一些简单的试剂
和一个用来加热的设备就行了
Mullis当时使用的酶
是大肠埃希菌DNA聚合酶的大片段
加热时容易失活
每次循环都需要重新加入
而且引物链的延伸是在37（摄氏）度下进行
很容易发生模板与引物之间的错配
产物特异性较差
后来Saiki又在温泉水中
提取了一种耐热的DNA聚合酶
Taq DNA多聚酶
这种酶我们目前应用的比较广泛
它可以使PCR技术扩增效率大大提高
此酶的发现使PCR得到了广泛的应用
这个酶它是耐热的
1988年初 另外一位科学家
也对所用的酶进行了改进
用的是T4 DNA聚合酶
提高了PCR扩增的真实性
大家知道 PCR一个分子能一下扩充到一亿个
中间如果发生错误的复制
它会把这种错误的复制传递下去
这样的话 （酶的）高保真性是非常重要
随后几十年PCR方法不断改进
它从一种定性的分析方法发展到定量的测定
从原来只能扩增几个kb的基因
到目前能够扩增长达几十个kb的DNA片段
我们花大篇幅讲PCR（技术）
是因为它非常重要 应用非常广泛
PCR一般是三个基本步骤
其实PCR是相对简单的
首先是变性
模板DNA需要变性 从双链变成单链
它经过加热 一般在93到95（摄氏）度
双链可以解离 然后形成单链
单链可以与引物结合
为下轮反应做准备
退火就是模板的DNA单链与引物相结合
延伸
DNA模板在引物结合下72（摄氏）度时
DNA聚合酶作用下
反应试剂里有游离的脱氧核苷酸
为反应原料dNTP
靶序列为模板 按照碱基互补配对的原则
合成一条新的与模板DNA链互补的复制链
这种新的链又可以作为下一次反应的模板
每完成一个循环大概需要2到4分钟
2到3个小时就能将目的基因
扩大到百万倍以上
大家可以看这个示意图
这个是DNA双链
这个是引物
这个是dNTP
模板经过解链变成单链
然后引物与模板结合
然后依照碱基互补配对的原则进行延伸
获得了一条互补的单链
然后DNA就复制了一倍
通过反复的几十个循环
这样DNA片段就得到大幅度的扩增
这个温度 变性一般是在93到95（摄氏）度
退火一般是55（摄氏）度到60（摄氏）度之间
延伸一般是72（摄氏）度
这样我们可以看到
由最初的一个DNA分子就是两条单链
然后扩增 30个循环以后
就达到了一个巨大的数字
PCR的反应体系里面包括了几样试剂
一个是dNTP 就是脱氧核醣核酸
包括dATP dTTP dCTP dGTP混合物 是等量的
Taq DNA聚合酶
它是可以帮助单链进行延伸的
引物就是与模板配对的 作为引子的
镁离子是作为反应的离子
然后就是蒸馏水
这上面列的是
一些试剂和里面的配的一些试剂
做一个PCR反应
我们需要一个PCR仪
PCR仪有自动化的程序
需要移液器 就是加样器
需要移液器吸头
它是（用于）吸取液体的
需要PCR板 或者是PCR管
这个板 一般是96孔板
它一次可以做96个反应
或者是PCR管 就是单管的
另外就是储存这个标本需要离心管盒
PCR的反应成分 一般的话
（反应体系）标准设置是100微升
但是我们在实际应用中可以10到25微升
在100微升反应体系里面10× Buffer
就是扩增缓冲液 是10微升
四种dNTP的混合物的浓度
大概是各200微摩尔每升
引物从10到100皮摩尔
模板一般是0.1到2个微克
DNA聚合酶是2.5个单位到5个单位
镁离子一般是1.5毫摩尔每升
这个知识点我们就讲到这里
-第1节 分子生物学的定义
--分子生物学的定义
-第2节 分子生物学的主要研究内容
-第3节 分子生物学发展简史与学习方法
-第一章 测试
-第一章 课件
--第一章 课件
-第1节 染色体
--染色体
-第2节 染色体病与染色体畸变
-第3节 常染色体病
--常染色体病
-第4节 性染色体病
--性染色体病
-第二章 测试
-第二章 课件
--第二章 课件
-第1节 细胞凋亡概述
--细胞凋亡概述
-第2节 细胞凋亡的分子机制
-第3节 细胞凋亡与疾病
--细胞凋亡与疾病
-第4节 细胞凋亡的检测
--细胞凋亡的检测
-第三章 测试
-第三章 课件
--第三章 课件
-第1节 单基因病的概念
--单基因病的概念
-第2节 常染色体显性/隐性遗传病
-第3节 X连锁显性/隐性遗传病
-第4节 Y连锁遗传病
--Y连锁遗传病
-第四章 测试
-第四章 课件
--第四章 课件
-第1节 基因的概念和组构
--基因的概念和组构
-第2节 基因分型
--基因分型
-第3节 基因组
--基因组
-第五章 测试
-第五章 课件
--第五章 课件
-第1节 基因结构与功能的生物信息学分析原理
-第2节 基因启动子及调控序列的结构分析方法
-第3节 基因编码区结构分析方法
-第4节 基因功能分析方法
--基因功能分析方法
-第六章 测试
-第六章 课件
--第六章 课件
-第1节 DNA甲基化与基因表达的表观遗传调控
-第2节 组蛋白修饰与基因表达的表观遗传调控
-第3节 染色质重塑与基因表达的表观遗传调控
-第七章 测试
-第七章 课件
--第七章 课件
-第1节 基因治疗的策略
--基因治疗的策略
-第2节 基因转移技术
--基因转移技术
-第3节 基因干预
--基因干预
-第4节 基因治疗的应用研究
-第八章 测试
-第八章 课件
--第八章 课件
-第1节 蛋白质分子的折叠
--蛋白质分子的折叠
-第2节 蛋白质分子的定位
--蛋白质分子的定位
-第3节 蛋白质的修饰
--蛋白质的修饰
-第4节 蛋白质的降解
--蛋白质的降解
-第九章 测试
-第九章 课件
--第九章 课件
-第1节 长链非编码RNA
--长链非编码RNA
-第十章 测试
-第十章 课件
--第十章 课件
-第1节 基因组学
--基因组学
-第2节 转录组学
--转录组学
-第3节 蛋白质组学
--蛋白质组学
-第4节 其他组学
--其他组学
-第十一章 测试
-第十一章 课件
--第十一章 课件
-第1节 PCR技术概述
--PCR技术概述
-第2节 PCR实验要点
--PCR实验要点
-第3节 PCR的应用及其衍生技术
-第十二章 测试
-第十二章 课件
--第十二章 课件
-第1节 蛋白质印迹概述
--蛋白质印迹概述
-第2节 蛋白质印迹实验流程
-第3节 蛋白质印迹常见问题分析
-第十三章 测试
-第十三章 课件
--第十三章 课件
-第1节 神经示踪的定义、用途、原理
-第2节 示踪剂的要求和分类
-第3节 神经示踪的应用
--神经示踪的应用
-第十四章 测试
-第十四章 课件
--第十四章 课件
-第1节 遗传修饰动物概述及应用
-第2节 动物遗传修饰策略
--动物遗传修饰策略
-第3节 遗传修饰常用技术
-- 遗传修饰常用技术
-第4节 动物遗传修饰实验方法
-- 动物遗传修饰实验方法
-第十五章 测试
-第十五章 课件
--第十五章 课件
