当前课程知识点：分子生物学 > 第六章 基因结构与功能分析 > 第2节 基因启动子及调控序列的结构分析方法 > 基因启动子及调控序列的结构分析方法
同学们好
我是中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我给大家介绍的这个知识点是
基因启动子及调控序列的结构分析方法
真核生物典型的启动子一般为Ⅱ类启动子
启动子通常位于基因的上游区域
拥有特征性的共有序列 包括三部分
一是核心启动子
典型的序列是TSS上游35bp区域内
第二是启动子上游元件
范围一般涉及TSS上游几百个碱基
含有GC盒 CAAT盒等几个调控元件
第三是启动子远端调控序列
范围涉及TSS上游几千个碱基
含有增强子和沉默子等
活化或抑制基因转录的调控元件
研究启动子结构的实验方法
常用的有PCR法
及近年发展起来的足迹法
DNA迁移率变动实验 报告基因分析法等
结合启动子功能分析的研究方法
首先我们介绍启动子克隆法
根据预测的基因启动子序列
设计引物 利用PCR技术扩增 克隆启动子
可测序分析启动子序列
足迹法是研究核酸-蛋白质相互作用的
一种常用方法
可分为酶足迹法和化学足迹法
酶足迹法是常用DNA酶Ⅰ
或具有3'到5'外切酶活性的
核酸外切酶切割DNA
它通过酶与DNA结合切割 然后测序
获得启动子序列
化学足迹法是利用能切割DNA骨架的化学试剂
处理DNA和蛋白质复合物
最常用的方法是羟自由基足迹法
电泳迁移率变动实验
它可以研究启动子
它是叫做EMSA又称凝胶阻滞实验
是利用核酸-蛋白质相互作用而建立的一种方法
用于检测DNA结合蛋白 确定启动子中
有核蛋白结合的顺式作用元件或调控区域
染色质免疫沉淀法也可以鉴定启动子
它的基本原理是在活细胞状态下
用甲醛固定蛋白质和DNA复合物
并随机打断成一定长度的染色质小片段
以目标蛋白的特异性抗体免疫沉淀
核蛋白和DNA复合物
通过PCR扩增DNA片段并进行鉴定
利用报告基因研究启动子活性或启动子捕获
报告基因技术是将报告基因置于
被研究DNA序列下游
通过检测报告基因表达水平可推断
该序列是否具有启动子活性
从而研究启动子结构和功能
什么是报告基因
是为了在细胞或动植物体内
设置灵敏方便的筛检信号
而采用一些表达产物极易检测的结构基因
如发光蛋白或酶编码基因
启动子捕获是利用报告基因构建的捕获载体
进行启动子筛选
启动子捕获载体是利用报告基因
快速有效筛选启动子的一种工具型载体
载体上含有一个无转录活性的报告基因
和报告基因上游的多克隆酶切位点
转录起始点TSS
是RNA聚合酶启动基因转录的关键点
真核生物中Ⅱ型RNA聚合酶负责结构基因的转录
Ⅱ类启动子相关的TSS序列
就成为分析结构基因的重要切入点
Ⅱ类启动子核心元件中
TSS位于TATA盒下游
是指与mRNA第一个碱基相对应的DNA序列
以+1位碱基表示
cDNA直接测序鉴定转录起始点
最早对TSS鉴定的方法
优点是简单
尤其适合于特定基因TSS的分析
缺点是对多个基因难以平行分析
而cDNA的5'端一旦延伸不全或降解
就会造成缺失 影响测定的准确性
cDNA末端快速扩增技术
它是在cDNA第一链合成的基础上
直接用末端转移酶
在cDNA 3'可变区加polyG尾
再利用已知的部分
设计一个新的引物和polyG引物一起
对锚定PCR扩增并对5'端进行测序
由于mRNA的5'端存在二级结构
在RACE方法上进一步改良
用寡核苷酸适配体代替mRNA的5'帽结构
并采用发光标记引物进行巢式PCR
称Deep-RACE
可实现高通量鉴定TSS的目的
在RACE方法的基础上
在转录本5'端加入
一个特定的限制性内切酶识别位点
可实现基因5'端的短片段串联
进行一次性测序 可同时分析多个TSS
这个知识点就介绍到这里
谢谢大家
-第1节 分子生物学的定义
--分子生物学的定义
-第2节 分子生物学的主要研究内容
-第3节 分子生物学发展简史与学习方法
-第一章 测试
-第一章 课件
--第一章 课件
-第1节 染色体
--染色体
-第2节 染色体病与染色体畸变
-第3节 常染色体病
--常染色体病
-第4节 性染色体病
--性染色体病
-第二章 测试
-第二章 课件
--第二章 课件
-第1节 细胞凋亡概述
--细胞凋亡概述
-第2节 细胞凋亡的分子机制
-第3节 细胞凋亡与疾病
--细胞凋亡与疾病
-第4节 细胞凋亡的检测
--细胞凋亡的检测
-第三章 测试
-第三章 课件
--第三章 课件
-第1节 单基因病的概念
--单基因病的概念
-第2节 常染色体显性/隐性遗传病
-第3节 X连锁显性/隐性遗传病
-第4节 Y连锁遗传病
--Y连锁遗传病
-第四章 测试
-第四章 课件
--第四章 课件
-第1节 基因的概念和组构
--基因的概念和组构
-第2节 基因分型
--基因分型
-第3节 基因组
--基因组
-第五章 测试
-第五章 课件
--第五章 课件
-第1节 基因结构与功能的生物信息学分析原理
-第2节 基因启动子及调控序列的结构分析方法
-第3节 基因编码区结构分析方法
-第4节 基因功能分析方法
--基因功能分析方法
-第六章 测试
-第六章 课件
--第六章 课件
-第1节 DNA甲基化与基因表达的表观遗传调控
-第2节 组蛋白修饰与基因表达的表观遗传调控
-第3节 染色质重塑与基因表达的表观遗传调控
-第七章 测试
-第七章 课件
--第七章 课件
-第1节 基因治疗的策略
--基因治疗的策略
-第2节 基因转移技术
--基因转移技术
-第3节 基因干预
--基因干预
-第4节 基因治疗的应用研究
-第八章 测试
-第八章 课件
--第八章 课件
-第1节 蛋白质分子的折叠
--蛋白质分子的折叠
-第2节 蛋白质分子的定位
--蛋白质分子的定位
-第3节 蛋白质的修饰
--蛋白质的修饰
-第4节 蛋白质的降解
--蛋白质的降解
-第九章 测试
-第九章 课件
--第九章 课件
-第1节 长链非编码RNA
--长链非编码RNA
-第十章 测试
-第十章 课件
--第十章 课件
-第1节 基因组学
--基因组学
-第2节 转录组学
--转录组学
-第3节 蛋白质组学
--蛋白质组学
-第4节 其他组学
--其他组学
-第十一章 测试
-第十一章 课件
--第十一章 课件
-第1节 PCR技术概述
--PCR技术概述
-第2节 PCR实验要点
--PCR实验要点
-第3节 PCR的应用及其衍生技术
-第十二章 测试
-第十二章 课件
--第十二章 课件
-第1节 蛋白质印迹概述
--蛋白质印迹概述
-第2节 蛋白质印迹实验流程
-第3节 蛋白质印迹常见问题分析
-第十三章 测试
-第十三章 课件
--第十三章 课件
-第1节 神经示踪的定义、用途、原理
-第2节 示踪剂的要求和分类
-第3节 神经示踪的应用
--神经示踪的应用
-第十四章 测试
-第十四章 课件
--第十四章 课件
-第1节 遗传修饰动物概述及应用
-第2节 动物遗传修饰策略
--动物遗传修饰策略
-第3节 遗传修饰常用技术
-- 遗传修饰常用技术
-第4节 动物遗传修饰实验方法
-- 动物遗传修饰实验方法
-第十五章 测试
-第十五章 课件
--第十五章 课件
