当前课程知识点：分子生物学 > 第十三章 蛋白质印迹 > 第2节 蛋白质印迹实验流程 > 蛋白质印迹实验流程
同学们好
我是中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我给大家介绍了这个知识点是
蛋白质印迹实验流程
实验流程包括七个步骤
一样品准备
二电泳
三转模
四封闭
五一抗孵育
六二抗孵育
七显影
蛋白质印迹实验流程
首先需要进行蛋白样品准备
分别将等量的不同处理组的蛋白样品加入EP管中
加入5X的上样缓冲液
95℃放置5-10分钟
使蛋白样品变性
在电泳开始前
我们需要制备SDS聚丙烯酰胺凝胶
将配制好
浓度为10%的分离胶溶液缓慢加入到胶室中
使凝胶高度约为玻璃板高度的2/3-3/4
室温放置约30分钟
待分离胶凝固后再次缓慢加入
配制好浓度为5%的浓缩胶
插入上样梳
室温放置约30分钟
使凝胶完全凝固
然后开始电泳
将配制好的凝胶放入垂直电泳仪中
缓慢加入电泳缓冲液
轻轻拔出上样梳
将变性后的蛋白样品
轻轻加入上样孔中
打开电源
使蛋白样品在电场中缓慢分离
待电泳结束后约2小时
就开始转膜
先将蛋白分离凝胶取出
放入转膜缓冲液
放入转膜缓冲液
裁剪与分离凝胶面积大小一致的PVDF膜
浸入甲醇溶液
30-60秒后
放入转膜缓冲液中
取出转膜仪
打开转移支撑体系
在转移支撑体系中依次按
负极 海绵 滤纸 凝胶
PVDF膜 滤纸 海绵
正极顺序放入凝胶和PVDF膜
放入转膜仪中
加入转膜缓冲液
接通电源
转移蛋白样品
转膜结束后约1.5小时
取出PVDF膜
使蛋白面朝上
依次进行5%的脱脂奶粉室
温封闭1小时
一抗4℃孵育过夜
二抗室温孵育2小时
上述步骤完成后即可显色
我们可以选择底物荧光法显色
打开荧光成像系统主机电源和软件
将二抗孵育后
PVDF膜放至荧光成像系统中相应位置
选择合适的曝光时间
进行曝光处理
获得显色图像
保存图片
样品准备包括裂解缓冲液
蛋白酶和磷酸酶抑制剂
就是防止蛋白降解
蛋白定量试剂
不同的样品
它的抽提液是不一样的
我们首先将样品
比如说细胞离心
然后通过收集蛋白
根据不同的细胞蛋白
采用不同的抽提液
蛋白抑制剂
是防止这个蛋白降解的
不同的抑制剂
它可以针对不同的蛋白
这里有这样一个表
比如说
抑酶肽它可以对应的是
胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶
血纤维蛋白溶酶等
它需要的浓度也列在这里了
蛋白定量的方法有多种
如考马斯亮蓝法
Folin-酚试剂法
二喹啉甲酸法和紫外吸收法
常见的考马斯亮蓝法
它是通过考马斯亮蓝G250
与蛋白结合形成蓝色化合物
在595nm处有最大吸收峰
化合物颜色深浅与蛋白浓度成正比
它的优点是操作迅速
消耗样本量少经济
缺点是高浓度的Tris EDTA
甘油和去污剂对测定有一定干扰
二喹啉甲酸法
也称BCA法
它是比较常用的一种方法
碱性条件下
蛋白质分子中的肽键
能与铜离子生成络合物
同时将二价铜离子还原成铜离子
并与二喹啉甲酸钠盐
结合形成稳定的蓝色复合物
该化合物在562nm处有高的吸光值
颜色深浅
与蛋白质浓度成正比
借此测定蛋白质浓度
它操作简单
复合稳定
灵敏性高
不受去垢剂影响
缺点具有较昂贵的费用
上样前准备一般是50-100μg糖蛋白质
它需要将蛋白质变性
95度 5到10分钟
需要上样缓冲液
电泳
电场作用下
蛋白质在聚丙烯凝胶中迁移速度
与其分子大小构型和所带的电荷相关
十二烷基
硫酸钠能与蛋白质结合
改变蛋白质原有构象电荷数 使不同的
蛋白质之间具有相同的构象和电荷
只存在分子量之间的差异
因此在SDS-PAGE中
蛋白质分子能与分子量大小区分开来
不同的凝胶浓度
分离不同的蛋白质
这是不同浓度胶的配方
配制胶时
注意胶内不要有气泡
因为气泡就影响某一道的
电源正负极不能接反
电泳缓冲液要新鲜配制
转膜
是将电泳分裂后的蛋白质从凝胶中
转移到固相载体上
如nc膜和PVDF膜
常用转移方法有湿转和半干转
湿转容易操作
转移效率高
半干转适用于用大胶的蛋白质转移
使用缓冲液少
转膜步骤以湿转为例
将胶浸于转移缓冲液中平衡5分钟
依据胶的大小剪取膜和滤纸
放入转移缓冲液中平衡5分钟
如用PVDF膜需用甲醇浸泡3-5秒
装配转移三明治
每层放好后用试管赶出气泡
将转移槽至于水域中放入三明治
加电泳缓冲液插上电极电泳
转模式需要注意
海面 滤纸 膜 胶 滤纸
海绵之间不能有气泡
正负极不能接反
要摸索最佳转膜时间
冰浴中进行
封闭只是对PVDF膜上未结合
蛋白的部分进行封闭
对已结合的蛋白的部位
不会有任何的影响
正常的封闭可以降低非特异性结合
常用的封闭液为5%的脱脂奶粉
或者是BSA
一抗选择
一般一抗说明书都列出该抗体
经试验验证
或者适用于何种分析类型
如可以用于WB IHC ICC ELISA 等
尽量选择验证过适用类型的抗体
分析蛋白来源的种属也要注意
一般抗体说明书都列出该抗体
经过验证并适用于何种动物或人的标本
如可以用于大鼠小鼠人等样本的实验
应选择物种相同或有交叉反应的抗体
分析蛋白质的结构性质也要注意
抗体由不同免疫原免疫宿主制备得来
免疫原包括
全长蛋白
蛋白片段
多肽等
抗体说明书一般都有免疫原的描述
如果打算检测的是蛋白片段
或蛋白全长的某一区域
则必须选用含有此片段区域的免疫原制备的抗体
对于分析一抗到宿主种类也要注意
偶联二抗结合无偶联的一抗时
一抗宿主动物的物种选择较为重要
对于WB而言
尽量选择与样本不同物种的一抗
从而避免二抗与样本内源性
免疫球蛋白产生交叉反应
例如检测小鼠样本的蛋白
则不应选择小鼠或大鼠的一抗
最好选兔源的一抗
一抗选择要注意
一抗的浓度
一抗抗体孵育的条件
二抗的选择要注意
一抗到物种来源
二抗必须是抗一抗来源物种的抗体
对于单克隆抗体
二抗需与一抗的类别或亚类相匹配
如果一抗是小鼠IgM
二抗就应当是抗小鼠IgM
如果一抗是小鼠IgG的某一亚类
那么几乎所有的抗小鼠
IgG都可以与之结合
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白
因此相应的二抗就是抗IgG抗体
选用哪种探针标记的二抗
耦联到二抗上的探针主要有酶
如辣根过氧化酶和碱性磷酸酶
荧光基团FITC RRX TR PE等和生物素
选用哪种探针标记的二抗主要取决于具体的实验
对于Western blot常用的二抗
就是酶标二抗和荧光基团标记的二抗
使用二抗的时候要注意
一抗的宿主
二抗稀释的浓度
二抗稀释液不能含叠氮钠
Western Blot显色的方法主要有以下几种
放射自显影
底物DAB显色
底物化学发光ECL
底物荧光ECF
放射自显影
是利用放射性核素发出来的射线
使感光材料中的卤化银等感光
实现放射性标记物的定位和定量的检测
优点是灵敏度高
分辨率好
保存时间长久
缺点是实验所用的放射性物质对人体有辐射作用
底物DAB显色的话
是利用3，3-二氨基联苯胺
可以和辣根过氧化物酶作用
形成褐色不溶性产物
对目的蛋白的显色
优点是操作简单
缺点是灵敏度低
现配现用
有效强的毒性
底物化学发光
ECL法检测
辣根过氧化物酶的原理是
辣根过氧化物酶在过氧化氢的存在下
氧化化学发光物质鲁米诺并发光
大部分Western blot显色底物是化学发光
它的特点是灵敏度高
但需要曝光检测设备或凝胶成像设备
底物荧光法是利用标记不同荧光染料
如CY2 CY3的二抗
分别对应相应的目的蛋白
通过检测荧光染料的信号强度
实现蛋白信号的检测
以进行精确的定量分析
它允许在同一张转印膜采用不同颜色的荧光底物
同时检测不同的目标
间接实现一次实验
可检测多种蛋白
这个知识点就介绍到这里
谢谢大家
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--分子生物学的定义
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-第一章 课件
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--基因的概念和组构
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--基因分型
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