神经示踪的应用在线视频

大家好 我是童建斌

来自中南大学湘雅三医院

今天我讲课的内容是神经示踪

该部分的内容主要包括三个方面

第一是神经示踪的定义 用途和原理

第二是示踪剂的要求和分类

第三是神经示踪的应用

今天我们学习第三个内容神经示踪的应用

神经示踪目前来说广泛运用神经科学的研究

其中脑网络就是应用最广泛的一方面

大家都知道

当我们的机体在面对环境改变的时候

我们的机体的运动系统、免疫系统

神经系统等等各个系统能够协调运动

然后使机体能够迅速的应对环境的改变

而在这个过程中间

肾上腺素系统起了极其重要的作用

但是为什么肾上腺素系统能够在

这么短的时间里面使机体能够

如此协调起来应对环境的改变呢

它结构基础是什么呢

目前来说 我们不清楚

而15年的这篇文章

就利用神经示踪的方法来回答了这样一个问题

在讲这个具体的实验之前

我们先介绍两个知识小点

第一个是狂犬病毒

这是狂犬病毒的基因的结构模式图

它包括五个基因

一个是核蛋白 一个是磷蛋白

一个是基质蛋白 一个是糖蛋白

一个是RNA聚合酶

进一步把糖蛋白的部位进行放大以后

我们得到下面的模式图

这是我们把糖蛋白的序列进行改变以后

得到的ΔG的序列

这是一个原始的环境病毒感染细胞情况

当我们感染细胞24小时的时候

细胞形态能够很好的显示出来

但到了48小时的时候

不光细胞的形态能够显示出来

而细胞的外面能够看见大量的病毒颗粒

这说明了细胞得到大量的复制

而我们把这个糖蛋白序列改变的这种狂犬病毒

标记细胞以后

发现24小时的时候也能标记细胞

但是48小时的时候

细胞外面没有像正常的野生型的

狂犬病毒一样的

产生大量的病毒颗粒

这说明G蛋白的改变跟狂犬病毒的

宿主的细胞的侵袭起了决定性的作用

基于这一点

所以大家对狂犬病毒进一步的改良以后

出现这种情况

当它用绿色荧光蛋白的基因序列代替

糖蛋白的序列以后

我们得到两种病毒

这是原始型的狂犬病毒

看清楚 它的有五个基因的这个序列都有

而这个红色的就是它的糖蛋白

这种狂犬病毒它能够多次感染宿主细胞

而且能够大量的复制

而这种狂犬病毒这是改良型的

它用绿色荧光蛋白的序列

代替了G蛋白的序列

所以这种病毒只能感染一次宿主细胞

而不能大量的繁殖

基于这种狂犬病毒的特性

所以进行了这个示踪的研究

这是用这种示踪的病毒

标记大脑皮质的神经元的情况

发现大脑皮质能够形态显示良好

而且胞体突起的显示完善

第二个知识点就是Cre-LoxP系统

而Cre是一种重组酶

它主要是来源于噬菌体

它最大的特点是能够特异性的识别LoxP位点

对LoxP位点进行剪切

然后重新的把剪切的断端连接起来

LoxP位点是一个34个碱基序列

而两端都是固有13个的碱基的重复序列

而增加使这个中间序列

这个就是Cre酶结合的位点

这就是常见的Cre-LoxP系统调节基因表达的两种形式

这是一个基因结构的模式图

这是基因的启动子序列

我们后面加一个LoxP位点以后

加一个终止密码子的话

接着加一个LoxP位点以后

这时我们目标基因后面融合了

GFP绿色荧光蛋白的序列

这种基因序列当我们反式作用因子作用

于这个启动子结合的时候

这种基因序列能够转录

但是遗憾的是由于它这个终止密码子的存在

所以这种基因序列不能够表达这个目标基因

而当我们在这种基因这种细胞里面加入Cre酶的时候

这情况也发生改变

它就会Cre酶跟着LoxP在这两个部位进行剪切

然后把这个断端重新连接起来以后得到这种序列

这种序列的反式作用因子情况下面

它能够进行转录

然后使目标基因进行表达

这是第二种常用的形式就是

它同样就是在这个两个LoxP位点中间

加入了目标基因的序列

但是这个基因序列是反向的

这个部位是有终止密码子的

所以这种情况下面这个序列同样的它能够转入

但是不能有效地翻译成这个目标基因的蛋白

而加入Cre酶以后

它能够在这个部位进行剪切以后

然后重新拼接

而部分的基因就会恢复正确的序列

然后实现这个目标基因的表达

所以这个15年这文章就基于这样三个方面

进行了实验设计

第一个是改良的狂犬病毒

它能够单次标记细胞

而这单次标记特性

能够使依赖糖蛋白的表达

第二个是Cre-LoxP系统

能够有效地调节基因的重组

第三是这个已知蓝斑的去甲肾上腺素能神经元

能够接受广泛的信息传入

同时能够发出纤维与广泛的脑区进行联系

同时能够发出纤维与广泛的脑区进行联系

所以基于这三点以后进行了这样的实验设计

基于前面的三个知识点

作者设计了如下的实验

这是A区神经元的胞体

这是它的轴突

这是B区神经元的胞体 这是轴突

这是C区神经的胞体 这是轴突

当我们在这个B区里面注射这两种病毒

一种是改良的这个狂犬病毒带绿色荧光蛋白的

一种单纯的带有狂犬病毒G蛋白序列的病毒

注射这以后

它能够把这个主动的摄取以后

进入B区神经元的胞体里面

然后使B区神经元胞体里面进行复制

然后重新组装成新的病毒

这种病毒是它有糖蛋白包裹的

绿色荧光蛋白的狂犬病毒

这种病毒分泌到胞外以后

能够被A区的这个神经元轴突

末梢主动摄取 然后经逆行运输

进入这个A区神经元胞体里面

然后使A区的神经元表达绿色的荧光蛋白

实现有效的标记

那么这样的办法能够回答

A区和B区之间有没有直接的突出联系

但是遗憾的就是

虽然这个方法能够回答A区和B区之间的突触联系

但是不能回答A区和B区之间

C区有没有直接的突触联系呢

目前仍不清楚

所以他们对这种方法进行进一步的改良

同样的他们的这个B区的神经元胞体周边注射了

这两种病毒

但这两个的病毒和前面的方法是不一样的

这两个的病毒是LoxP位点调控的

所以这两个的病毒注射完了以后

他能够主动的把B区的神经元的胞体摄取

摄取完了以后

由于它有LoxP里面序列之间有stop终止密码子

所以这两种蛋白在这个B区的神经胞体

不能够得到有效的表达

所以不能标记为B区的神经元

但是当我们 他们为了使

B区的神经元里面蛋白进行表达

所以他们在C区里面注射带Cre酶的病毒

注射带Cre酶的病毒以后

能够被B区神经病的轴突末梢主动地摄取

然后经逆行的运输

达到了B区神经元的胞体里面

由于带有Cre酶的存在

它把两个LoxP这样序列进行剪切以后

重新拼接以后

能够使这个荧光蛋白和

这个糖蛋白进行有效的表达

然后重新包装以后

形成这种G蛋白包裹的

带绿色荧光蛋白的序列的病毒

然后分泌到胞外以后

然后被A区的神经元的轴突末梢主动的摄取

然后逆行的运输

达到A区的神经元胞体里面

从而表达使A区的神经表达绿色荧光蛋白

所以实现有效的标记

通过这样我们在A区的细胞

表达绿色的荧光蛋白以后

我们就能回答

A区与B区之间直接的突触联系

B区C区之间直接的突触联系

这是基于这种情况所以作者

进行了在实物上面进行这样的注射方式

这是一个小鼠的脑袋

这是它的头端 这是它的尾端

当我们的C区注射Cre酶

B区注射这个病毒以后

我们能够使A区的细胞显示绿色

通过这样多点的注射以后

作者发现这样一个规律

在大脑的肾上腺素系统里面存在

A区的细胞一个神经元

它能够发出多个突起与

B区的多个细胞发生突触联系

而B区的任何一个细胞能够接受

A区的多个细胞的突触投入

同样的B区的细胞也能够发出突起

与多个的C区的细胞发生突触联系

所以就存在一个总分总的这种联系方式

所以这就能够很好地解释

为什么在机体应激的时候

肾上腺素系统能够迅速的把整个

神经系统能够整合起来

使机体能够迅速的应对环境的改变的情况

所以这个结果就发在15年的Nature上面

另外一种情况神经示踪种常用的就是

用于在体的这种神经元树突棘的标记

这是一个正常情况下大鼠的树突棘的情况

这是它的轴突 这是树突棘 这是正常的

这是当我们在腹腔里面注射生理盐水以后

经过第二天的时候发现

有双光子检测的时候这个树突棘的形态改变不明显

但是如果是在腹腔里面注射

致炎物质 poly （I:C）以后

发现第二天的时候这个树突棘

数目明显的少于正常的情况

所以这就很好地诠释外周的炎症对神经系统的影响

这部分结构发表到2017年Nat Med上面

前面讲了神经示踪的两个应用的例子

那么怎样做好神经示踪呢

要想做好神经示踪我们首先要明白

要根据自己的实验目的

各种示踪剂的特性选取合适的神经示踪剂

第二个就是我们要根据脑的图谱

或者自己检测的神经环路

示踪剂的特性确定以下三个方面

第一个是运输的时间

第二个是切片的时候检测的平面和方位

第三个是注射的坐标一定要稳

第三个大的方面我也正好我们强调的就是

我们在做立体定位注射的时候

这个立体定位你一定要摆在水平的桌面上面

这点对保证有效的立体定位就是特别重要的

今天的课就到这 谢谢大家