当前课程知识点：分子生物学 > 第六章 基因结构与功能分析 > 第3节 基因编码区结构分析方法 > 基因编码区结构分析方法
同学们好
我是中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我给大家介绍的这个知识点是
基因编码区结构分析方法
基因编码区 它是
编码功能性基因产物的结构基因部分
基因终产物为多肽链或者是RNA
基因编码区通常是指
基因中能够编码蛋白质多肽链的
一段核苷酸序列
基因编码区序列具有一定的结构特征
为基因编码区的鉴定分析提供了线索
基因编码区结构特征体现在成熟的mRNA上
以mRNA为模板 通过反转录合成cDNA
成为基因编码区结构分析的基础
进一步克隆测序或构建cDNA文库
是研究基因结构的最早最常见的方法
我们介绍一个cDNA文库的概念
它是指细胞全部mRNA为模板
反转录合成cDNA的总和
通过cDNA文库
可筛选分析基因组中的编码序列
从而确定基因编码区结构
或者是称之为发现新基因
构建cDNA文库
首先应考虑每条cDNA序列的完整性
从cDNA文库中调取感兴趣的目的基因
可利用PCR法靶向性扩增出来
RACE法可通过对cDNA末端序列检测
经过多次扩增和测序分析
最终获得基因的全部编码序列
RNA剪接分析法
采用DNA微点阵和交联免疫沉淀等技术
对RNA剪接进行高通量分析
是目前主要可行的方法
DNA微点阵又称DNA芯片
常用的是代表外显子的DNA阵列
或外显子交接的DNA片段阵列
CLIP分析是利用免疫沉淀检测
RNA剪接体
基因的拷贝数分析
什么是基因拷贝数
它是指某一种基因或某一特定DNA序列
在单倍体基因组中出现的数目
基因拷贝数变异
是指介于单核苷酸多态性
及染色体异常之间的
中等长度DNA片段变异
大小可从kB到MB范围
属于亚显微结构变异形式
可以发生删除 插入 复制 复合多位点等变异
其中在群体中分布频率
大于百分之一的CNV称拷贝数多态性
基因的拷贝数分析方法常用的是实时定量
PCR方法检测目标基因拷贝数
实时定量荧光PCR或数字PCR
最常用于单个目的DNA片段CNV的检测
特别适用于低拷贝基因的定量
对多区域位点测定
可选择短荧光片段的多重定量PCR
以及多重可连接探针技术
检测已知目标基因拷贝数也可采用杂交技术
包括荧光原位杂交 Southern blot
多重可扩增探针杂交等
芯片技术可用于检测基因组拷贝数变异
DNA芯片技术是检测
基因组拷贝数变异的有效方法
用于CNV检测方法主要有
微阵列比较基因组杂交和SNP芯片
以及逐步发展的新一代直接测序技术
我们可以看到在一个芯片上
可以点上万甚至几百万个点进行检测拷贝数变异
微阵列比较基因组杂交是将一定比例
不同颜色荧光标记的样品混合液
包括待测样本和对照样本
在同一张芯片上同时进行杂交
通过检测样本基因组和对照基因组之间
荧光强度比值来反映DNA的CNV
aCGH芯片探针可覆盖整个基因组
它的主要探针来源于
细菌人工染色体和寡核苷酸两种
基于细菌人工染色体克隆文库的aCGH
是最早用于分析全基因组DNA拷贝数的方法
主要用于判断较大 较复杂的DNA删除
也就是缺失或者是扩增的总数
SNP芯片是目前通量最高 使用范围最广的
全基因CNV分析技术
它不需要同时使用两个样本
试验组和对照组 和探针进行双杂交
它只要使用单杂交就可以完成
因为它的点很多
所以相互之间可以作为对照获得数据
通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度
从而确定每个点相对的基因拷贝数
新一代直接测序技术对鉴定CNV有推动作用
它可以对整个基因组
或者是基因组的某一特定区域进行测序
测序方法的优点是
不需要知道更多的背景知识和设计工作
并能鉴定出复杂的结构变化
同时克服杂交固有的一些缺陷
比如说是探针杂交的丢失
因此随着测序成本降低 有很好的发展前景
这个知识点就介绍到这里
谢谢大家
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--分子生物学的定义
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-第四章 测试
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-第1节 基因的概念和组构
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-第2节 基因分型
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-第3节 基因组
--基因组
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-第3节 基因编码区结构分析方法
-第4节 基因功能分析方法
--基因功能分析方法
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--PCR技术概述
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