当前课程知识点：分子生物学 > 第十二章 聚合酶链式反应 > 第2节 PCR实验要点 > PCR实验要点
同学们好
我是来自中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我们讲的这个知识点是PCR实验要点
首先我们看看模板 是几乎所有形式的
DNA和RNA都是PCR的合适底物
这包括基因组DNA 质粒DNA
噬菌体DNA 预先扩增的DNA
cDNA和mRNA
相对而言短的简单的DNA越好扩增
扩增的靶序列一般在500 bp以内
以100到300 bp为佳
尽管可以扩增到几十kb的片段
但是我们常规Sanger测序一般是100到300 bp
扩增较长的PCR片段模板
质量是要求非常严的
要抽提纯化DNA应最大限度避免损伤
尽可能减少反复吹打
吹打时容易使得DNA发生损伤断裂
一般我们要选用大口径吸头
避免对DNA随机剪切
我们做实验的时候
用到大的移液器的吸头
我们甚至用剪刀先把它剪掉一截
就是扩大它的口径
减少对DNA的随机损伤
PCR的反应液一般随Taq DNA聚合酶供应
标准的反应液一般是50 mM的氯化钾
然后还有Tris盐酸和镁离子
镁离子在这里面是非常重要的
浓度对反应物的特异性和产量有影响
一般1.5到2毫摩尔的终浓度
浓度过高 特异性降低
浓度过低 产物降低
样品含EDTA或其它螯合物
可增加镁离子浓度
因为它会降低反应效率
高浓度的DNA和dNTPs时需要调节镁离子浓度
三磷酸脱氧核苷
一般是储存在(pH) 7.0的氢氧化钠里面
要负20度冰箱保存
我们要尽量的减少冻融
因为这样的话会影响反应
我们一般来了这个试剂以后进行分装
它的使用浓度20到200微摩尔每升
四种dNTP要等浓度配合以减少错配发生
因为DNA模板本身它是四种碱基
基本上是均衡分配的
高浓度dNTPs易产生错误掺入
过高无扩增 过低降低反应物的产量
dNTPs能与镁离子结合
使游离的镁离子浓度降低
引物 首先我们看看引物的定义
一小段单链的DNA或者RNA
核酸合成反应时作为每个多核苷酸链
进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链
合成时需要引物是因为DNA聚合酶
可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上
在引物的3'-OH端
核苷酸以二酯链形式进行合成
引物的3'-OH必须是游离的
设计的目的要找到一对合适的核苷酸片段
能有效的扩增DNA模板
所以引物是进行设计的
优劣直接关系到PCR特异性与成功与否
有一些软件我们可以看到
它是可以进行引物的设计的
就是你有一段核苷酸链的序列它进行引物设计
包括用的最多的就是Primer3
用百度一搜就可以找到Primer3的不同版本
然后我们可以进行引物设计
引物设计的基本原则
引物长度以15到30 bp为宜
一般GC
就是G加C的含量在45%到55%之间
Tm值高于55（摄氏）度
Tm值我们有个简易的计算方法
就是G加C的数量乘以4
加上A加T的数量乘以2
引物的3'端 不应与引物的内部有互补
避免内部形成二级结构
两个引物在3'端不应出现同源性
以避免形成引物二聚体
这是什么意思呢
就是引物如果易形成二聚体
就是引物之间相互搭起来 相互为模板扩增
这样的话
可以甚至扩增到几百个bp
就是说与你目的片段的大小差不多
人工合成的寡核苷酸引物需PAGE
或离子交换HPLC进行纯化
引物浓度不宜过高
过高有两个缺陷
一个是因容易形成引物二聚体
二是当扩增微量靶序列时
容易产生非特异性产物
引物一般以TE配成高浓度的母液
保存于-20（摄氏）度
使用前取出一部分稀释
DNA聚合酶的选择
Taq酶一般扩增效率高又比较便宜
扩增6 kb以下的片段出错率是10的-5次方
Pfu它保真度最高
出错率10的-6次方 扩增2 kb以下的片段
Taq plus扩增效率比Pfu高
保真度比Taq酶好 扩增10 kb以下的片段
Hotstart Taq酶这是一种特殊的Taq酶
它是经过化学修饰的耐热的DNA聚合酶
常温下活性被化学基团封闭了
94到95（摄氏）度加热数分钟后
有时候是15分钟
这个酶恢复正常的活力
避免了起始循环低温度下的非特异性扩增
提高了灵敏性和特异性
长Taq酶具有3'到5'
外切酶活性的耐热DNA聚合酶
扩增效率高 错配率低
简单模板扩增可达40 kb
复杂模板也可达15 kb
Platinum Taq酶它是热启动
高保真的耐热的DNA聚合酶
对保真度要求很高而用Pfu扩增时
如果有困难就选用 一般扩增长度达4 kb
不同的实验对酶的选择不一样
克隆普通长度的DNA
一般Taq Taq Plus
保真度要求高的时候 片段要求比较短
如点突变 基因筛选
就用Pfu Taq Platinum
高保真长片段的扩增
如构建基因图谱 分子遗传学研究用
Long Taq Taq Plus
扩增基因组模板需要降低背景时
就是背景比较高 杂带比较多
用Taq Platinum 热启动酶等
实时荧光定量PCR反应一般用Taq
Hotstart Taq Taq Platinum
从细菌或质粒模板做筛选鉴定目的克隆
扩增6 kb以下的片段
用Taq Taq Plus
或者是混合包装的试剂盒
模板比较复杂的或者是目的片段丰度低
用普通Taq酶扩增不出来的
就用这种试剂盒 这种Pfu PCR试剂盒
PCR循环中预变性模板DNA完全变性与
PCR的完全激活对PCR是否成功至关重要
建议加热时间参考试剂说明书
一般未修饰的Taq酶结合时间为两分钟
循环中的变性步骤
一般是95（摄氏）度30秒可以使靶序列完全变性
时间过长会损害酶的活性
过短靶序列变性不彻底
容易造成扩增失败
退火一般根据引物的Tm值
比Tm值低5（摄氏）度
正常比如说是六十二三（摄氏）度
你就采用五十七八（摄氏）度进行引物的退火
引物的延伸一般是72（摄氏）度进行
推荐1 kb以下的Pfu是1分钟1 kb延伸时间
循环数一般是25到40个循环
过多容易产生非特异性扩增
最后一个循环后 反应在72（摄氏）度维持5到15分钟
使那些没有扩增好的单链退火成双链
PCR产物检测一般有两种方式
一种是琼脂糖凝胶电泳
这种方式最为简便易行 最常用
做胶时间非常快 但是它有一个缺陷
就是染色的时候要使用一种致癌的物质
有些实验室不方便处理
另外一种是聚丙烯酰胺凝胶电泳
它的话做胶比琼脂糖凝胶电泳的凝胶要复杂
但是它的分辨率清晰度相对好一些
大家可以看到包括这些背景都看的比较清楚
PCR实验要点
PCR反应需要注意的事项是
特别注意防止DNA相互之间的污染
容易产生假阳性的结果
公用的没有设密码的PCR仪
经常使用时 要检查PCR程序是否正确
你不能调用这个PCR仪里面的这个程序
你没仔细看
就开始按机器开始
他可能就是被别人改过了
变成一个错误的程序
不要使用过量的试剂
过量的试剂容易产生非特异性的扩增
试剂购回后一般要分小份保存
一个是防止污染
第二个是减少冻融对试剂的损害
加完所有的试剂后要用移液器头吹打几次
以保证充分混匀
使用阴性对照
可以检测污染的发生
使用阳性对照有助于良好扩增样本
电泳时使用DNA分子量标准品
要判断这个PCR产物
是否跑出凝胶或者是PCR是否失败了
扩增较长 GC含量高的模板应该使用添加剂
比如说DMSO
它的话就更容易使模板打开
能够扩增
最好当天的电泳产物（当天）进行检测
这样的话可以减少降解
大于48小时以后的话
可能带形不规则甚至消失
这个知识点就讲到这里
谢谢大家
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