当前课程知识点：分子生物学 > 第十三章 蛋白质印迹 > 第3节 蛋白质印迹常见问题分析 > 蛋白质印迹常见问题分析
同学们好
我是中南大学湘雅三医院的邓昊
今天我给大家介绍的这个知识点是
蛋白质印迹常见问题分析
管家基因编码
多种组织和细胞中稳定表达的蛋白
这种管家基因编码的蛋白用于
检测整个Western blot实验过程
及体系是否正常工作
并作为半定量检测目的
蛋白表达量的标准对照
我们要注意这个样本种属来源
哺乳动物组织或细胞来源样本
一般选择GAPDH β-actin α-tubulin等
植物来源的样本一般选择
plant actin Rubisco等
其它研究较少的样本
一般参考相应的文献报道
选择合适的蛋白作为内参
第二 注意目的蛋白分子量
应保证目的蛋白
与内参蛋白分子量相差5 KDa以上
防止检测干扰
如目的蛋白分子量为45 KDa
不宜选用β-actin作内参
因为β-actin分子量是42 KDa
可考虑选用GAPDH 它的分子量是36 KDa
或β-tubulin
目的蛋白表达部位
也是一个需要注意的地方
我们根据目的蛋白表达部位不同
而选用不同的抗体
常用的核内参抗体有这样一些
而膜蛋白检测的常用抗体
是Na+/K+-ATPase
线粒体蛋白的检测常用
这个VDAC1和COX IV作为内参抗体
如果我们发现在实验过程中无信号
或信号弱可能是
检测样本不表达或低表达的蛋白
我们应该选择表达量高的细胞作为阳性对照
也可能是转膜不完全
和过渡分子量太大或太小的蛋白
应增加或缩短转膜的时间
无信号或信号弱
也可能是
一抗与二抗不匹配
或不能识别抗原
应选择针对一抗来源的种属抗体
或者认真阅读说明书
确定其是否能识别
目的蛋白种属抗原
一抗孵育不充分或者洗膜过度
建议使用4℃孵育过夜
洗膜时间不宜过长
去污剂（浓度）不宜过高
二抗受叠氮钠抑制
也可能导致无信号和信号弱
应避免这个叠氮钠
和HRP标记抗体一起使用
背景较高可能是
未进行特异性封闭或封闭不充分
应延长封闭时间
或者考虑使用更合适的封闭剂
也可能是一抗浓度过高
稀释一抗体至合适浓度
以更高稀释度抗体孵育更长时间
耗时长但特异性结合最好
第三 可能是因为膜太干燥了
孵育过程中任何步骤
都应保证膜有充分的反应液
避免出现干膜现象
第四 缩短曝光时间
多带现象
可能是由于目的蛋白
有多个剪切体或修饰位点
如泛素化 乙酰化和糖基化等
这样的话我们就要
查阅文献和生物信息学分析可能性
多带也可能是由于蛋白质发生了降解
所以在蛋白裂解过程中要加入蛋白酶抑制剂
避免蛋白的反复冻融
多带也可能是由于一抗的特异性不好
要选择特异性强的单克隆抗体
而不应用多克隆抗体
多带也可能是由于
一抗或二抗浓度过高
可以降低抗体浓度
或者是孵育时间
实验过程中也应注意安全问题
实验操作时要戴手套
操作有毒或挥发性试剂要戴口罩
并在通风橱中进行 如丙烯酰胺
N，N-甲叉双丙烯酰胺 TEMED等
废弃物要严格按照
实验室废弃物处理制度来处理
这个知识点就介绍到这里
-第1节 分子生物学的定义
--分子生物学的定义
-第2节 分子生物学的主要研究内容
-第3节 分子生物学发展简史与学习方法
-第一章 测试
-第一章 课件
--第一章 课件
-第1节 染色体
--染色体
-第2节 染色体病与染色体畸变
-第3节 常染色体病
--常染色体病
-第4节 性染色体病
--性染色体病
-第二章 测试
-第二章 课件
--第二章 课件
-第1节 细胞凋亡概述
--细胞凋亡概述
-第2节 细胞凋亡的分子机制
-第3节 细胞凋亡与疾病
--细胞凋亡与疾病
-第4节 细胞凋亡的检测
--细胞凋亡的检测
-第三章 测试
-第三章 课件
--第三章 课件
-第1节 单基因病的概念
--单基因病的概念
-第2节 常染色体显性/隐性遗传病
-第3节 X连锁显性/隐性遗传病
-第4节 Y连锁遗传病
--Y连锁遗传病
-第四章 测试
-第四章 课件
--第四章 课件
-第1节 基因的概念和组构
--基因的概念和组构
-第2节 基因分型
--基因分型
-第3节 基因组
--基因组
-第五章 测试
-第五章 课件
--第五章 课件
-第1节 基因结构与功能的生物信息学分析原理
-第2节 基因启动子及调控序列的结构分析方法
-第3节 基因编码区结构分析方法
-第4节 基因功能分析方法
--基因功能分析方法
-第六章 测试
-第六章 课件
--第六章 课件
-第1节 DNA甲基化与基因表达的表观遗传调控
-第2节 组蛋白修饰与基因表达的表观遗传调控
-第3节 染色质重塑与基因表达的表观遗传调控
-第七章 测试
-第七章 课件
--第七章 课件
-第1节 基因治疗的策略
--基因治疗的策略
-第2节 基因转移技术
--基因转移技术
-第3节 基因干预
--基因干预
-第4节 基因治疗的应用研究
-第八章 测试
-第八章 课件
--第八章 课件
-第1节 蛋白质分子的折叠
--蛋白质分子的折叠
-第2节 蛋白质分子的定位
--蛋白质分子的定位
-第3节 蛋白质的修饰
--蛋白质的修饰
-第4节 蛋白质的降解
--蛋白质的降解
-第九章 测试
-第九章 课件
--第九章 课件
-第1节 长链非编码RNA
--长链非编码RNA
-第十章 测试
-第十章 课件
--第十章 课件
-第1节 基因组学
--基因组学
-第2节 转录组学
--转录组学
-第3节 蛋白质组学
--蛋白质组学
-第4节 其他组学
--其他组学
-第十一章 测试
-第十一章 课件
--第十一章 课件
-第1节 PCR技术概述
--PCR技术概述
-第2节 PCR实验要点
--PCR实验要点
-第3节 PCR的应用及其衍生技术
-第十二章 测试
-第十二章 课件
--第十二章 课件
-第1节 蛋白质印迹概述
--蛋白质印迹概述
-第2节 蛋白质印迹实验流程
-第3节 蛋白质印迹常见问题分析
-第十三章 测试
-第十三章 课件
--第十三章 课件
-第1节 神经示踪的定义、用途、原理
-第2节 示踪剂的要求和分类
-第3节 神经示踪的应用
--神经示踪的应用
-第十四章 测试
-第十四章 课件
--第十四章 课件
-第1节 遗传修饰动物概述及应用
-第2节 动物遗传修饰策略
--动物遗传修饰策略
-第3节 遗传修饰常用技术
-- 遗传修饰常用技术
-第4节 动物遗传修饰实验方法
-- 动物遗传修饰实验方法
-第十五章 测试
-第十五章 课件
--第十五章 课件
