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我们今天来继续讲述精准医学这门课

很高兴为大家讲授这门课程

我是来自山东大学基础医学院遗传学系的刘奇迹

今天我们这堂课的主要内容是罕见病的基因发现与鉴定

既然讲的基因发现

我们看一下发现致病基因的四大策略

第一个是上个世纪八十年代之前采用的候选基因的方法

以及第二种方法是伴随着人类基因组计划实施

建立起了连锁分析和定位克隆的这么一个策略

从2005年开始出现了一种方法

叫GWAS

GWAS叫全基因组关联分析

这主要是针对复杂疾病易感基因分离的一个方法

从2009年开始

二代测序大规模地应用于单基因病以及常见疾病致病基因的发现

这是我们说到目前为止发现致病基因四大主要策略

下面我们一一逐渐的来解释

对罕见病来说

伴随着人类基因组计划实施

一个经典的策略就是我们图中所示的这个策略

通过人类孟德尔遗传

我们通过对疾病进行详细的临床诊断

通过家系分析

我们对确定它的遗传方式究竟是常染色体显性

还是X连锁隐性

还是常染色体隐性等等

进行不同的遗传方式的判断

判断完遗传方式由我们通过连锁分析来对致病基因定位

通过对致病位点一个精细的定位

把致病基因所在的染色体区域做一个明确区域的判定

然后对候选区内基因序列进行突变筛查

找到候选基因

然后对基因功能进行体内外深入的分析

对表型进行确认

最终发现致病基因

这是一个发现罕见病致病基因的经典的策略

第一种方法我们先来看叫功能克隆

功能克隆顾名思义

就是说从基因的功能入手来在定位克隆这个致病基因

先研究相关基因的功能

然后再来分离致病基因

比如说他有常见的有两种方式

第一种方式就是通过疾病的表型与动物或者人类中某一种表型非常类似

而后者比如在动物和人类中这种表型已知

这种致病基因是已知的

因此可以把这个家族或这一类基因作为一个候选基因进行分析

比如说在动物或人类中发现了某一个导致血糖异常的基因

那么这个基因

我们就可以把它作为人类糖尿病里的候选基因来进行分析

明确他究竟是不是导致糖尿病发病的基因

另外一种是

根据疾病的分子病理机制提示致病基因可能是某一个基因家族的成员

如说在人类中有很常见的一种病就是智力低下

我们已经发现了很多智力低下的基因

比如说这种核糖体蛋白

这个基因的家族导致智力低下

假设我们发现了一个智力低下和有核糖体蛋白突变

导致了智力低下的疾病

它的分子病理机制和表型非常相似

那我们就可以把核糖体蛋白基因

作为候选基因对我们研究的这个智力低下来进行分析

这就是功能克隆

就是根据基因的功能来判断可能作为这个疾病的候选基因来进行分析

给大家举一个例子

我们知道人类中有一个X连锁隐性遗传病

就的甲型血友病

这个病呢他有非常古老历史

在几百年前在这个致病基因发现之前

我们就明确了它是由于体内缺失了凝血因子VIII

这个基因或者说是编码凝血因子VIII的这个基因发生了突变

导致体内没有了正常功能的凝血因子VIII或是VIII因子

这也就是说

我们首先了解了这个基因的功能

知道VIII因子这个基因或者这个蛋白

他的异常导致了血友病的发生

因此我们就可以从VIII因子入手

我们从正常人的外周血中分离得到VIII因子这个蛋白

然后通过蛋白测序得到这个蛋白质的部分氨基酸的序列

通过氨基酸的序列

可以按照这种中心法则逆向推出编码这个VIII因子部分的mRNA序列

大家在这里可能说

我们从mRNA序列按着密码子的这种法则

我们可以很容易地推出氨基酸的序列

但是由于密码子的简并性

一个氨基酸往往是有多个密码子来进行编码的

如何来已经推算

这个时候我们可以选择密码子简并性比较小的氨基酸区域

以及设计多种可能的mRNA序列

根据推出的mRNA序列

我们设计基因特异的这种探针

所谓探针就是一些寡核苷酸单链的一些DNA序列

我们来筛选外周血液的cDNA文库

通过调出这种相关的cDNA文库

从而得到甲型血友病致病基因的部分序列

从这个部分的序列入手

我们就可以明确基因的染色体定位

进而在患者之中对第VIII因子序列进行基因突变检查

从而找到它的突变

这也就是说

从基因的功能是从VIII因子它的蛋白序列或者说它的功能入手

我们推导基因染色体的定位

就是功能克隆的一个非常典型的例子

第二个例子

是Noggin基因发现的例子

这是一个真实例子

我们在人群中发现了有一种表型

叫做近端指趾关节粘连

也叫做多发性骨性关节粘连

这个病的主要症状就是手指的部分关节出现了一些骨性连接

我们的手指大部分都是两个关节

分成了三截

但是这些病人

他往往在早期发育过程中

他没有指的小关节了

他没有新的关节而形成一个骨性连接

但是不明确他的致病基因究竟是位于哪条染色体上

就在这个时候

在science上发表了一篇文章

他的题目就是Noggin基因在软骨发生以及关节发生过程中起着一定的作用

这个研究小组利用Noggin敲除的小鼠对他表型进行了分析

发现敲除Noggin基因的小鼠脚趾和手指出现了一些骨性连接

非常类似于我们在群体中看到了人类的这种症状

那么大家去想

既然在小鼠中敲除了Noggin基因出现了和人类相似的表现

那么我们是否有理由推断人类这些骨性连接异常的这些病号

是不是有可能是Noggin基因突变引起的

因此

把Noggin基因拿来在这患者中进行了突变检测

结果

果不其然

在不同的家系中

1-7不同的患者中确实发现了不同的突变

这个图的上半部分

代表的是核苷酸的机械检测

DNA序列的一些检测

发现了不同的突变

那么下图代表的是这些突变导致氨基酸改变的一些情况

从这可以看出

明确的有这种氨基酸的改变

患者都有Noggin基因的突变

那么从而就证实了Noggin基因突变是导致了我们人类中的这种表型

那么大家想

这个例子完全就是从小鼠中已知的表型

他的致病基因已知

我们把这个致病基因能拿来作为一个候选基因进行突变的检测

这个文章了几个月以后就发表Nature上

那么也就是说

发现人类致病基因的疾病表型

在小鼠模型中与人类表型非常类似

因此那把这个导致小鼠表型的这个基因就选择作为候选基因进行突变检测

就是这么一个例子

这就是我们说候选克隆

或者说功能克隆这么一个例子

那么这个方法呢

大家想想它是非常受限制的

也就是说

他只能依赖于我们前面对基因的功能蛋白的功能非常明确

另外这个基因的蛋白非常容易分离

还有在这些小鼠中有特殊的表型的

与提示和人类的表型非常相似

但这是在正常实践活动中非常受限制的

所以说因此

这种功能克隆的方法主要是在上世纪八九十年代之前应用

我想呢

今天我们的课基本上就讲到这里

谢谢大家