3在线视频

我们今天来继续讲授《精准医学》这门课

那很高兴为大家讲授这门课程

我是来自山东大学基础医学院遗传学系的刘奇迹

那么今天我们这堂课的主要内容是罕见病的基因发现与鉴定

伴随着人类基因组计划的实施

我们说出现了一种新方法

叫做定位克隆

这个定位克隆

它和功能克隆是完全不同的一种方式

它是从疾病的表型入手

先对基因在染色体上的一个物理定位进行定位

然后再分离基因的序列

通过利用突变检测以及功能分析证明基因和疾病的这种关系

那么也就是说

它是从表型入手来先从基因的物理位置开始入手来分离基因的序列

证明基因和疾病之间的这么一个关系

那么这就是我们前面说的定位克隆

我们前面有一个PPT已经讲过了

这是罕见病在九十年代分离罕见病的一个非常常见的一个方法

那么从这个图中我们可以看出

整个定位克隆分成这么几步

第一步

大家看左边是一个家系图

这个家系图涂红色的代表是患者

方框代表是男性患者 圆圈代表是女性

涂红色的圆圈代表女性患者

那么大家看

这一共四代

每一代都有患者

并且男女发病率基本上是类似的

这说明什么

这表明它是一个常染色体显性遗传

那么常染色体显性遗传代表什么呢

代表致病基因一定是位于1到22号常染色体上

对吧

那好

我们就把目光锁定在这1到22号常染色体上

因为1到22号常染色体涵盖了上万个基因

那究竟哪个基因是呢

这个时候我们通过遗传图

通过连锁分析

来明确地把它锁定到某一条具体的染色体的某一区某一带

也就是说把这个致病基因定位到一个非常狭小的区域

定位以后

我们在第二步进行物理图

也就是构建这个候选区域的整个物理图

然后

我们认为绝大多数的罕见病都是由于外显子区域

也就是说编码蛋白质的序列发生了突变引起的

也就是说我们不关心那些基因间的序列

我们关心的是定位在这个区域的一些可转录的序列

因为这个时候要构建转录图

拿到这些外显子序列以后

我们通过对外显子进行一个个的测序

建立一个个基因的序列图

比如说

那么我们在某一个基因之中发现了有一个C到T的突变

本来这个C到T

那么这个C是它的密码子构成是CAA

它编码的一个是谷氨酰胺

它变成了C

变成了T以后

那么CAA的密码子就变成了TAA

TAA是个什么呢

大家知道

TAA是一个终止密码子

也就是说蛋白的翻译到此终止

这是一个无义突变

由于一个碱基的改变

C到T的改变

导致编码的氨基酸

有一个密码子由一个编码氨基酸的密码子变成了终止密码子

所以导致出现一个截短蛋白

那么可能就导致了疾病的发生

大家看

这整个定位或者发现疾病基因的过程要构建四个图

遗传图

物理图

转录图

序列图

我们说

人类基因组计划其过程就是构建这四个图的过程

因此我们说定位克隆

就是伴随着人类基因组计划实施而出现和发展的这么一种方法

那么既然说定位克隆

顾名思义就是通过首先对基因它的位置入手来分离致病基因的

首先我们看第一步构建遗传图的这个过程

构建遗传图的过程的是完全根据摩尔根的连锁互换定律发生的

那我们看左边是两条同源染色体

一个蓝色的一个黄色的来自父亲和母亲的两条染色体

那么这两条染色体上面我们标记了一个绿色的一个红色的

这两个是等位基因

这两个位点

我们知道在减数分裂的过程中

由于连锁互换

这两个位点它可能就会发生交换

结果大家看

在右边这个图上

那么有两条姊妹染色单体本来是绿色和红色在一起

那么由于交换那么蓝色的和黄色的染色体就发生了片段的交换

从而导致了重组的染色体

我们构建遗传图谱过程

就是利用了连锁互换基本的这种原理

那么也就是说首先利用基因多态位点

最开始是我们利用的是STR短串联重复序列多态位点

当然现在我们更多的是用SNP芯片进行连锁分析

检测致病基因共同传递的等位基因

那么

做了这一步以后呢我们要计算LOD score值

来判断出现共同传递的这种现象是由于连锁

是位于同一条染色体上

还是位于不同的染色体上它自由组合导致的

那么从右下角这个图中我们比如说

大家看

在一条染色体上我们有一个多态位点

它的等位基因是3

那么这个致病位点我们用D来表示

由于这两个位点呢

它非常近

大家可以想在传递的过程中

它就会出现什么情况

就是说这条染色体因为它两者非常近

很少会发生重组

所以呢

它就这个等位基因3和这个致病基因就一起传递

也就是说患者从亲代得到致病基因成为病人的同时

它同时携带了等位基因3

而右边这条染色体

假设这个等位基因3和这个致病基因相距有一定距离

那么在传递过程中

可能就会由于重组

这个等位基因3和致病基因并不完全连锁

那么这就是说

我们说连锁互换的一个基本的一个道理

那么当这个LOD score值我们要进行一个统计学分析

也就是说θ代表的是重组率

我们说H0是假设

也就是说这两个位点之间

它θ等于二分之一

也就是说是自由组合的

重组率等于二分之一是自由组合

也就说不连锁

那么H1

假设θ小于二分之一

认为是连锁的

那么也就是说那么以log以10为底的对数

分子我们说是当θ等于一定重组率的情况下

支持现有减数分裂项的这么一个数据

分母是等于自由组合的这么一个数据

当LOD score值大于1的时候

表示这两个位点之间存在连锁

大于3的时候

表示肯定连锁

大家想想LOD score值等于3代表的是什么

log以10为底的对数就是说分子是分母的一千倍

也就是说支持连锁的概率是自由组合连锁概率的一千倍

那么代表它是一定连锁的

对吧

当LOD score值小于-2时

表示是否定连锁

认为出现这种情况它代表是由于自由组合而导致的

那么也就是说

连锁分析类基本的一个流程是通过基因型的多态性

通过根据孟德尔定律建立连锁不平衡

我们进行数据过滤

然后呢

通过优化遗传模式

也就是说通过参数或者非参数分析对候选区域一个大致范围进行一个基本的确定

然后通过单体型作图来进一步精细定位确定候选区域

这是这么一个精确的过程

由于时间关系

那么我们如何计算LOD score值以及如何进一步判断

我们不再进行详细地讲述

我们下面看一下一个大体的给大家的一个示意的一个过程

比如说我们发现这么一个家系

就像刚才我们看了一个家系

是一个常染色体显性遗传的这么一个家系

也就是说

患者是第一代

实际上父亲

他是一个患者

他和一个女性婚配又生了四个子代

三个男孩

一个女孩

那么其中一个男性和一个女孩发病

那么进一步再往下传每一代都有患者

我们判断它是个常染色体显性遗传

我们在构建遗传图的过程中

比如说我们就用D2S132这个多态位点

这是一个STR多态位点的一个标记

D代表是DNA的片段

2代表是2号染色体

S代表sequence或者segment片段

123是个流水编号

那么代表这个位点

它是2号染色体上的一个多态位点

它的物理定位是明确知道的

那么通过基因分析

大家看

那么这个23 14代表的是这些个体携带这个多态位点的等位基因

那么我们从第二代也可以看出

这两个患者分别从他的父亲得到了等位基因2和等位基因3

那么这两个正常的个体

也是得到了等位基因2和等位基因3

再往下看

那么这个男34

这个男性患者

他传递给子代的时候

他把等位基因3传递给了子代

然后呢这个女性患者再往下传的时候

这两个患者有的得到了等位基因3

有的得到了等位基因5

那么这是一个什么情况

大家说

这明确的就不是一个连锁的

这代表这个等位基因

这个D2S123和这个致病基因很可能是位于两条不同的染色体上

这纯粹是一个自由组合

对吧

因此我们计算LOD score值

发现确实它小于-2

明确其实不连锁

那么右边我们当我们做到

比如说D3S132

3号染色体上的一个多态位点的时候

我们发现了这个现象

男性患者23

他和携带等位基因14的女性婚配

生了两个患者

分别携带了等位基因是31和34

那么我们从这看到一个巧合的现象是

这两个患者都从患病的父亲那儿得到了等位基因3

那我们再来看他表型正常的同胞都从患者的父亲那得到了等位基因2

那么再往下看

第三代这个患者从父亲那得到的等位基因3

而他的表型正常的两个同胞都是得到了等位基因4

最后一代

那我们看

这四个子代之中

两个患者同样也是从患病的母亲那儿得到了等位基因3

而两个表型正常的同胞

得到了等位基因5

从这我们看

是不是等位基因3和这个致病基因是出现了共同传递这个现象

对不对

所以对这些患者都是从最初的那个患者得到了一个致病基因

比如说我们用致病基因A来表示

他们得到A的同时成为患者

那么同时他们还得到了等位基因3

那么这就像我们刚才讲的

那么等位基因3和致病基因很可能是在同一条染色体上

并且物理位置非常近

因此出现了共同连锁这个现象

那么

我们通过计算LOD score 值

它的LOD score值等于3.1

那么也就是说

我们认为这个位点

它和致病基因是紧密连锁的

所谓连锁呢

那我们看 用一个示意图

D3S132在这个区域之中

那么这个致病基因就在这个132的附近

但是在它的上游还是下游呢

我们并不明确

这个时候呢我们从D3S132这个多态位点附近

我们选择更多的多态位点来进行分析

那么我们再来看

当我们做到462的时候

D3S462的时候发现

大家看第二代的患者得到了等位基因3

第三代的患者得到了等位基因3

那么第四代大家看

这两个患者其中有一个患者

这两个患者都得到了等位基因3

那么其中第四代的这有一个正常的个体

大家看中间的这个女性患者正常的子代

他从患病的母亲这儿

也得到了等位基因3

也就是说

她是一个正常的个体

她从母亲这儿得到了正常的等位基因

但她得到了等位基因3

这个表明什么了

表明在这儿出现了一次重组

也就是说

这个致病基因和正常的等位基因之间出现了一次重组

那么代表这个致病基因的下边界就位于D3S462的上游

那么我们就把致病基因的下边界定出来

通过同样的方法

我们定位到

把这个上边界做到345的时候呢

在这个家系中同样发现了

大家看第四代的这个患者

在这个家系中绝大多数患者都是携带了等位基因6

对不对啊

也就是说

代表等位基因6 和致病基因是连锁的

但是

第四代的最后一名女性患者她从患病的母亲这得到了等位基因1

她没有得到等位基因6

同样的情况我们判断在这儿出现了一次重组

也就是说

致病基因的上边界就位于345附近

这样呢

我们就把致病基因定位在D3S345到D3S462这两个多态位点之间的区域

致病基因它就位于这个区域

这是一个构建连锁图的过程

这样呢

我们就把致病基因从整个1到22号常染色体

为什么说是1到22号常染色体呢

就这个例子来说

因为我们说他是一个常染色体显性遗传的致病基因

因此它的致病基因只能是位于1到22号常染色体上

我们从这么大的一个区域精细定位到三号染色体上

D3S345到462之间这么一个区域

接下来我们通过构建物理图

当然构建物理图是一个非常非常费力的一个过程

构建转录图

我们在这个区域内

通过某一个基因的一个外显子序列中发现一个C到T的突变

结果证实呢

这个C到T的突变导致了一个无义突变

那么进一步证实它可能就导致了疾病的发生

这就是定位克隆的一个过程

那么这个定位过程通过连锁分析

制作连锁图

制作物理图

转录图的过程

是一个非常费力的过程

那么

伴随着人类基因组计划的实施并完成

到现在我们出现了另外一种方法

叫定位候选克隆

也就是说

当我们进行定位以后

我们不需要再进行制作物理图

我们只需通过数据库中查找定位区域中有哪些已知的基因

把这些基因序列拿来进行突变检测

直接就可以来定位

找到基因的突变

那么这个过程大大加快了寻找致病基因的过程

那么举一个例子

是X连锁智力低下致病基因定位候选克隆的这么一个过程

那么从这个家系图中我们可以看出

有一个非常明显的特点是什么

所有的患者都是男性

另外那么我们再来看这些男性患者他们的关系

都是什么

兄弟关系

表兄弟关系

舅舅和外甥的关系

对不对啊

这代表什么

那么我们仔细分析

这是一个典型的X连锁隐性遗传的家系

对不对啊

也就是说这些男性患者的母亲她都是携带者

她两条X染色体上其中一条携带了致病基因

家系中的Ⅰ2这个女性去世了

她很可能是个携带者

她把致病基因传给了Ⅱ2这个女性

那么Ⅱ2又传递

依次往下传

那么也就是说致病基因就位于X染色体上

但位于具体的那个区域呢

我们不知道

那么这是患者的一些他的一个表现

除了智力低下之外还有一些小头

然后语言的问题

舌发育异常

骨骼发育异常等一系列的这么一个异常

然后呢我们就通过基因组分析

基因组扫描呢

把这个致病基因就定位到了DXS8064和DXS8050之间

为什么说定位在这个区域呢

大家看

DXS8064那么我们就从看到这个Ⅲ1 Ⅲ2 Ⅲ3第三代的这三个男性

大家看这三个男性呢有两个男性是正常的

其中一个表型正常的同胞

但是大家看

他们都从母亲这得到了一条X染色体

带有等位基因3的X染色体

这显然是不对的

因为Ⅲ2他是一个患者

因为从这个图中我们可以看出

所有的患者都得到的是等位基因2比如说Ⅱ4 Ⅱ5 Ⅲ4 Ⅲ5

但唯独这个Ⅲ2这个患者呢得到了等位基因3

说明了在这出现了重组

同样的情况我们可以看8050

DXS8050

这个8050大家看他的重组出现在哪里呢

Ⅱ4和Ⅱ5第二代的这两个男性患者

分别从母亲那得到了等位基因2和等位基因1

那么同样这提示它出现了重组

那么致病基因呢我们就把他定位在

8050和DXS8064这大概14.6个cM这一个候选区域之内

然后我们分析这个区域呢

这是在他的一个物理图的一个定位

那么我们用箭头示意了这两个Marker所在的位置

那么这个区域内呢一共有多少个基因呢

大约有将近一百个候选基因

我们对这些基因呢进行了分析

那么大家看这些基因的名字

对这些基因呢我们根据它的功能

它的表达模式和疾病的致病方式我们进行了分析

结果在一个CUL4B这个基因内我们进行测序的时候呢

发现了一个C到T的突变

从下面的测序图中可以看出

对男性患者

因为男性只有一条X染色体

所以他都是一个半合子

那我们看左边是一个正常对照

他是一个C

那么右边是一个患者

他是发生了一个突变是个T

那么C到T的这个突变在这个CUL4B里头他的编码序列发生了什么呢

那我们看这是这个基因的开放阅读框

这个C

上面我们用红色标记的

它正常的开放阅读框中它是一个CGA编码的是第370位的氨基酸是个精氨酸

那么C变成T以后呢这个密码子CGA就变成了TGA

我们知道TGA是个终止密码子

因此也就是说它编码的氨基酸把370位的精氨酸呢变成了一个终止密码子

而这个CUL4B他的蛋白呢全长是913个氨基酸

大家可以想想他在翻译终止以后

这个蛋白很可能是一个丧失功能的突变

更重要的是大家看我们这个蛋白

他在500多位以后还有个CULIN的结构域

那么整个这个结构与就丢失了

而导致了基因功能的丧失

从而导致了疾病的发生

当然我们后续还做了一系列其他功能的验证

和小鼠的动物模型呢证明了这个基因

这是整个CUL4B这个致病基因发现的过程

那么除了我们做的这个工作之外呢

随后呢

其他小组的工作在这个CUB4B这个基因

也发现了更多的突变在不同的家系中发现了不同的突变

那么进一步明确了CUL4B这个基因的丧失功能突变

导致了X连锁智力低下的综合征

那么这就是一个X连锁智力低下的这个致病基因的发现

一个CUL4B这个致病基因的发现

好那我们还是回到精准医学

也就是说我们前面讲到

罕见病的他的精准医学就在发现致病基因后

可以为家系成员提供基因诊断

那么就拿到这个例子来说

我们分离这个家系的致病基因拿到CUL4B这个致病基因的它的突变之后呢

可以为这个家系做什么呢

那么我们知道这种X连锁遗传方式的疾病呢

他由于绝大多数女性是携带者

带有致病基因

尽管她不发病

但她在在生育之后呢

她同时可以把致病基因传给她的男性子代

男性子代得到致病基因

有二分之一就会发病

因此

那我们可以对这些家系中所有正常的女性进行携带者检出

也就是说看这些女性有没有携带这些CUL4B的基因突变

如果她携带了基因突变那我们提醒她

她将来怀孕以后我们可以做产前诊断避免男性患儿的再次发生

从而为这个家系提供疾病干预的这个服务

另外一个

我们拿到了了解了这个智力低下它的新致病基因以后呢

我们可以对致病基因的功能进行深入的研究

而了解它为什么导致了疾病的发生

了解这个疾病发现的机制进而后面为药物的开发设计提供一个新的靶点

这是一个致病基因发现的这么一个定位候选克隆发现致病基因的这么一个例子

那么前面我们用这个示意图可以看出

定位候选克隆也好

定位克隆也好

候选功能克隆也好

我们就相当于在整个基因组中来寻找一个基因

就像我们在深夜的大街上我们丢了钥匙

那我们也仅仅能在路灯照亮的地方来进行寻找

那么在路灯照不到的地方我们是无能为力的

也就是说那个时候我们对基因组它的认识是有限的

因此大大限制了我们对致病基因发现的速度

我想今天我们的课基本上就讲到这里

谢谢大家