当前课程知识点：临床生物化学检验 > 第四章 酶学检测技术 > 4.2 酶偶联法测定酶活性 > 4.2 酶偶联法测定酶活性
由于酶偶联技术的应用
连续监测法的应用范围得以大大地扩展
下面我们给大家介绍什么是酶活性测定的酶偶联法
及几种临床诊断酶试剂盒的偶联测定反应实例
目前 大部分酶都无法直接测定
因为需要S与P间有理化
特性的显著差异
才可进行直接连续监测
所以常常采用间接连续监测酶活性
酶偶联法属于间接连续监测法
间接连续监测法包括
经典间接法和酶偶联方法
(1)经典间接法 要求显色剂对酶活性无影响
如下是一个经典间接法的例子
S在酶作用下生成P
P能与显色试剂反应生成呈色产物
对呈色产物的连续检测
即可监测该酶的活性
但有一个要求 显色试剂对酶反应没有影响
因而限制了它的应用
受生化物质代谢中
多种酶串联催化构成代谢通路的启示
人们巧妙的设计了由两种
或两种以上的酶偶联在一起测定酶的方法
这就是酶偶联法
酶偶联方法原理如下
S在待测酶作用下生成待测产物
其中Ex为待测酶 Px为待测产物
由于S与待测产物（Px）之间
没有可检测的理化特征差异
不能直接检测
此时引入一个酶催化待测产物
生成具有可检测特性的产物
该产物称为指示产物
催化该反应的酶称为指示酶
(2)酶偶联方法
与指示酶偶联已成为应用最广
使用最频繁的方法
其中指示酶(Ei) 常用脱氢类 如 LDH
酶偶联的连续监测法按偶联方式
分为直接偶联和间接偶联
什么是直接偶联呢
直接偶联是指
待测酶(Ex)+指示酶(Ei)的偶联
反应如下 A在待测酶作用下生成B
B经指示酶催化生成指示产物C
指示酶Ei的字母i为indicator的缩写
直接偶联法的特点是
①A B无法直接检测
②需用Ei来催化→C C可监测
Ei—指示酶的定义是
能提供直接监测的产物
起指示偶联反应作用的酶(常为脱氢酶)
什么是间接偶联呢
间接偶联是指
当无合适的指示酶(Ei)直接与待测酶(Ex)偶联时
可加入另一种酶来将待测酶与指示酶连接起来
反应如下 A在待测酶（Ex）作用下生成B
B无法直接检测
加入另一种酶（Ea）催化生成C
C在指示酶作用下生成指示产物D
这个另外加入的酶（Ea）为辅助酶
小写字母a为 assistant的缩写
Ea—辅助酶的定义是
与指示酶联系 辅助偶联反应进行的酶
下面展示几个临床诊断酶试剂盒的偶联反应实例
第一个实例是肌酸激酶（CK）
底物为肌酸磷酸＋ADP
在CK作用下生成肌酸＋ATP 无法直接检测
加入己糖激酶（HK） 以 ATP为底物
另外加入一个底物葡萄糖
经己糖激酶（HK）催化生成 G-6-P和ADP
该反应仍无法直接检测
再加入另一种酶葡萄糖6磷酸脱氢酶（G-6-PDH）
以 G-6-P 和氧化型辅酶I（NAD+）为底物
催化生成还原性辅酶I （ NADH +H+）
和 葡萄糖酸-6-P内脂
还原性辅酶I （ NADH +H+）
对340纳米紫外光有强吸收
利用该特征可直接监测反应进程
同学们看看这是什么方式的偶联呢
这是一个间接偶联法
CK是待测酶 HK是辅助酶
G-6-PDH是指示酶
指示产物是原性辅酶I （ NADH +H+）
通过340纳米紫外波长的监测
可测定指示产物还原性辅酶I的生成
并由它推算出待测酶CK的活性
第二个实例是丙氨酸氨基转移酶（ALT）
底物为 L-丙氨酸＋α-酮戊二酸
在待测酶 丙氨酸氨基转移酶 催化作用下
生成产物 L-谷氨酸＋丙酮酸
无法直接检测
再以丙酮酸＋NADH＋H+为底物
经 LDH催化生成 L-乳酸＋NAD+
利用还原性辅酶I （ NADH +H+）
对340纳米紫外光的吸收特性
监测还原性辅酶I的减少
来推算待测酶ALT的活性
同学们看看这是什么方式的偶联呢
这是一个待测酶ALT+指示酶LDH的直接偶联
第三个实例是天冬氨酸氨基转移酶（AST）
与上述ALT测定相似 这是一个直接偶联
底物 L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸
在待测酶AST作用下
生成 L-谷氨酸＋草酰乙酸
再以草酰乙酸＋NADH＋H+为底物
由指示酶苹果酸脱氢酶（MDH）
催化生成产物 L-苹果酸＋NAD
通过监测还原性辅酶I的减少
来推算待测酶AST的活性
通过上述临床诊断酶试剂盒的偶联反应实例介绍
我们看到经过直接偶联或间接偶联的方法
原本不能进行连续检测的酶
可以实现准确连续的监测
为临床酶测定提供了重要的工具
同学们 关于酶偶联法测定酶活性就介绍到这里
谢谢大家
-1.1 绪论
--1.1 绪论
--1.1 绪论
-第一章知识点测试
-2.1 检验方法的评价
-2.2 临床生化检验分析质量指标
-第二章知识点测试
-3.1 参考区间
--3.1 参考区间
--3.1 参考区间
-3.2 医学决定水平
-3.3 诊断性能评价
-第三章知识点测试
-第一周测试
-4.1 酶活性测定有哪些方法？
-4.2 酶偶联法测定酶活性
-4.3 酶循环法
--4.3 酶循环法
--4.3 酶循环法
-4.4 酶活性单位
-4.5 同工酶
--4.5 同工酶
--4.5 同工酶
-4.6 如何上机设定测定酶活性的K值？
-第四章随堂测试
-5.1 自动生化分析仪
-5.2 后分光技术
-5.3 试剂盒双试剂
-5.4 自动生化分析仪的基本结构
-第五章知识点测试
-第二周测试
-6.1 血清总蛋白的检测
-6.2 血清蛋白质电泳
-6.3 急性时相反应蛋白
-6.4 C-反应蛋白与超敏C-反应蛋白
-6.5 高尿酸血症与痛风
-第六章随堂测试
-7.1 血糖及影响因素
-7.2 葡萄糖的检测
-7.3 口服葡萄糖耐量试验
-7.4 HbA1c的检测
-7.5 糖尿病自身抗体的检测
-7.6 尿白蛋白的检测
-7.7 糖尿病的实验诊断
-第七章知识点测试
-第三周测试
-8.1 血脂
--8.1 血脂
--8.1 血脂
-8.2 血浆脂蛋白
--8.2血浆脂蛋白
-8.3 载脂蛋白
--8.3 载脂蛋白
--8.3 载脂蛋白
-8.4 原发性高脂蛋白血症的临床检测
-第八章随堂测试
-第四周测试
-10.1 微量元素的检测
-10.2维生素的测定
-第十章知识点测试
-11.1 疾病时血清酶活力改变的机制
-11.2 常用血清酶在部分疾病时的改变
-第十一章随堂测试
-第五周测试
-12.1 转氨酶与肝实质细胞损伤
-12.2 肝纤维化的生物化学检测概况
-12.3 肝纤维化的生物化学检测指标
-12.4 黄疸发生的生物化学机制
-12.5 黄疸发生的生物化学鉴别诊断
-第十二章随堂测试
-13.1 肾脏疾病生物化学检验项目的选择与应用
-13.2 肾脏疾病的病例讨论
-第六周测试
-14.1 心肌损伤的生化标志物与应用
-14.2 心衰的生化标志物与应用
-第十四章随堂测试
-15.1 钙磷镁代谢异常及其检测
-15.2 骨代谢激素调节、异常及其检测
-15.3 成骨标志物及其检测
-第十五章随堂测试
-第七周测试
-16.1 下丘脑-垂体功能检查
-16.2 甲状腺功能检测
-16.3 肾上腺髓质功能检测
-16.4 肾上腺皮质功能检测
-第十六章随堂测试
-17.1 胰腺炎的生物化学检测
-第八周测试
-18.1 部分神经系统疾病的临床分子病理及实验室检测
-18.2 阿尔茨海默病的分子病理与实验检测
-18.3 脑脊液的生化检测
-第十八章随堂测试
-19.1 妊娠相关疾病诊断指标
-19.2唐氏综合征的产前筛查与产前诊断
-第九周测试
-20.1 治疗性药物监测
-第二十章知识点测试
-21.1 临床毒物检测
-21.2 铅中毒的检测
-21.3 酒驾的检测
-第十周测试
-第二十一章知识点测试
-期末考试
