6.1 血清总蛋白的检测在线视频

同学们好

今天我们介绍

与血清总蛋白的

检测相关的内容

首先我们先要明确

什么是血清总蛋白质

血清总蛋白质

是血清中包含的所有蛋白质的总称

种类可以达1000种以上

这些蛋白质

绝大部分是由肝脏合成的

此外γ-球蛋白由浆细胞来合成

还有极少部分蛋白质

由内皮细胞或其他细胞合成

它们合在一起

就构成了血浆中的固有蛋白质

正常情况下

血浆固有蛋白质的总量

会维持在一个正常范围内

对成年人来说

大约在65 g/L～85 g/L之间

含量最多的12种血清蛋白质

会占到总量的95%以上

其中

仅白蛋白这一种蛋白质的含量

就可以超过总量的50%

可见绝大多数种类的蛋白质

都是微量存在于血液中

疾病发生时

体内蛋白质的结构

种类 含量 分布以及功能

都会发生改变

因此采用恰当的技术方法

检测体内蛋白质的改变

对疾病的诊断

病情的监控

以及预后判断都有重要的价值

对于血清总蛋白质含量的检测而言

无外乎两个方面

一个超出正常范围的上限

另一个是低于正常范围的下限

我们把血清总蛋白浓度

超过85 g/L称为增高

其具体的原因

可能有血浆浓缩失水

和血清蛋白合成增加两个方面

前者可以是因为呕吐 腹泻

高热 大汗等原因

而造成机体急性脱水

也可以是由于使用了脱水剂

利尿的药物

或者患有

慢性肾上腺皮质功能减退等疾病

而引起血浆的浓缩

而后者的可能原因

包括慢性炎症时

多克隆免疫球蛋白合成增多

或者是发生多发性骨髓瘤

巨球蛋白血症等浆细胞病的时候

有大量的

单克隆免疫球蛋白的合成

当血清总蛋白浓度

在65 g/L以下的时候称之为降低

这其中除了

由于水分增加致使血浆被稀释

造成蛋白质浓度下降以外

主要是因为白蛋白浓度的减少

而使总蛋白减少

比如

长期食物中的蛋白供应不足

或者因为慢性肠道疾病

影响蛋白质吸收而导致营养不良

以及患有严重的结核病

甲状腺功能亢进

长期发热 恶性肿瘤

等消耗性疾病时

均可导致血浆蛋白质的消耗增加

又比如

严重的肝功能损伤

可以导致蛋白质的合成出现障碍

其中主要表现为

白蛋白浓度的显著下降

血清总蛋白浓度的降低

还可以是因为蛋白的大量漏出

例如

肾病综合征时会有大量蛋白

特别是白蛋白

从尿中丢失

严重烧伤时会有大量血浆的渗出

外伤大出血

或者是溃疡性结肠炎等

均会造成血浆蛋白质的丢失

那么

究竟有哪些方法

可以用于血清总蛋白质的测定呢

具体来说

可以有以下几种方法

一个是凯氏定氮法

是血清总蛋白测定的参考方法

另一个是临床首选的常规方法

称为双缩脲法

此外还有酚试剂法

紫外吸收法

染料结合法和比浊法等

都可以用于血清总蛋白的检测

需要指出的是

目前并没有一种

通用的常规技术方法

能够适合所有类型

蛋白质的总量的测定

都有一定的局限性

下面我们先来介绍双缩脲法

两个尿素分子

可以缩合成为双缩脲分子

双缩脲分子在碱性溶液中

可以和二价铜离子作用

产生稳定的紫红色络合物

这被称为双缩脲反应

而双缩脲法测定

血清总蛋白浓度的原理

就是利用了双缩脲反应

血清中蛋白质的

两个相邻的肽键

在碱性溶液中

也可以与二价铜离子

发生类似的作用

生成稳定的紫红色络合物

而且生成物在540nm

有最大光吸收

其颜色深浅

与血清蛋白质含量成正比

这样一来

我们就可以通过检测

生成物的吸光度

来得出血清蛋白质的浓度

根据2013年

中华人民共和国国家卫生行业标准

双缩脲法测定

血清总蛋白浓度的参考区间

是成人65～85 g/L

血清总蛋白浓度

随年龄增大有所增高

但60岁以后则稍有下降

卧床者比直立行走的成人

稍微降低

儿童血清总蛋白浓度

随年龄增大变化幅度较大

新生儿时在46～70 g/L之间

2岁以下在51～75 g/L之间

3岁以上的儿童

其血清总蛋白浓度

就可以达到60～80 g/L

接近成人的水平

双缩脲法特异性高

试剂单一 方法简单

由于需要

至少含两个肽键

才能与二价铜离子络合反应

因此氨基酸

和二肽对本方法没有干扰

血清中其它小分子肽的含量极低

可以忽略不计

双缩脲试剂的呈色一致性

在目前所有总蛋白测定方法中

是最好的

由于

双缩脲法的呈色强度与肽键数量

也就是蛋白质的含量成正比

因此双缩脲试剂

对各种蛋白质的呈色强度

基本相同

而且显色稳定

双缩脲法检测的线性范围

在10～120g/L

灵敏度虽然不高

但完全适用于

血清总蛋白的定量测定

综合以上的特点

双缩脲法

是目前临床测定血清总蛋白时

首选的常规方法

这种方法的局限性

主要是可以受到

某些因素的干扰

而影响其结果的准确度

这些因素主要有右旋糖酐

脂浊血标本

溶血标本

严重的黄疸以及某些抗菌素等等

凯氏定氮法

建立于1883年

是经典的蛋白质测定方法

凯氏定氮法的测定依据

是蛋白质中含氮量较为恒定

平均为16％

也就是说1克氮相当于6.25克蛋白质

这样一来

通过准确测定样品中的含氮量

就可以推导出样品中的蛋白质含量

凯氏定氮法

包括样品消化和氨的蒸馏两个部分

蛋白质是含氮化合物

经过与硫酸加热分解

在有催化剂存在的条件下

将会生成硫酸铵

硫酸铵再与浓碱作用

采用蒸馏法将氨蒸馏出来

并被硼酸吸收

最后将硼酸铵用标准盐酸滴定

根据标准盐酸的消耗量

就可以算出总氮量

进而再折算成蛋白质含量

由此可见

凯氏定氮法所测定的蛋白质结果

定量十分准确

无论是精密度 灵敏度

还是回收率都非常高

并且可以适用于固态

液态等一切形态的样品

检测的优势非常突出

但是凯氏定氮法的操作复杂

不论是蛋白样品的消化

还是氨的蒸馏

都需要比较长的流程

费时费力

因此不适合作为常规方法

在临床上面应用

何况血清样品中

各种蛋白质的含氮量

并不是绝对的遵循16％的规律

不同蛋白之间存在少许的差异

尤其在疾病状态下

这种差异可能会更大

所以

凯氏定氮法

是目前公认的测定

血清总蛋白的参考方法

主要是用于测定蛋白质的定值

以及对其他测定方法进行校正

酚试剂法的检测原理

是利用蛋白质中的酪氨酸残基

和色氨酸残基能

能还原磷钨酸-磷钼酸试剂

起蓝色反应

经改良后

先用碱性铜溶液与蛋白质反应

再加入酚试剂

能够将磷钨酸和磷钼酸

还原成钨蓝

和钼蓝这样一些蓝色物质

酚试剂法呈色的灵敏度很高

可以达到双缩脲法的100倍左右

因此它特别有利于

检出较微量的蛋白质

但是由于各种蛋白质中

酪氨酸残基

和色氨酸残基的含量差别

可能很大

所以酚试剂法的专一性不高

只适合测定单一种类的蛋白质

不适合测定混合蛋白质

此外

该方法容易受到

还原性化合物的干扰

比如带巯基的化合物

糖类 酚类等等

紫外吸收法

是根据蛋白质分子中的

芳香族氨基酸

在280nm处有最大吸收峰

而核酸的最大吸收峰为260nm

它在280nm处

也有比较强的光吸收

因此我们可以测量样品

在上述两个波长处的吸光度值

再通过公式予以校正

这样就可以计算出

样品的蛋白质浓度

紫外吸收法运用简单实用

不需要加任何的其他试剂

和进行特殊处理

只需要测量样品在

260nm和280nm处的吸光度值

这样一来

它可以保留样品的生物活性

以及回收全部蛋白质

因此常用于酶

免疫球蛋白等

纯化的蛋白样品的测定

同时

该法的准确性

受蛋白分子中

芳香族氨基酸含量的影响非常大

而且尿酸和胆红素等物质

在280nm附近有干扰

所以它并不合适作为常规方法

用于血清这样的

组成复杂的蛋白质测定

最后我们简略地了解一下

染料结合法和比浊法

染料结合法的原理

是蛋白质分子可以在酸性环境中

解离成带正电荷的氨基离子

与染料阴离子产生颜色反应

常用的染料有氨基黑

丽春红 考马斯亮蓝

邻苯三酚红钼等

例如邻苯三酚红-钼酸盐

与蛋白质所形成的复合物

在600nm处吸光度

与蛋白质浓度成正比

比浊法

是指某些酸如三氯乙酸

磺基水杨酸

苄乙氯铵等

能与蛋白质结合

而产生微细的沉淀

由此产生的悬浮液的浊度

其大小

与蛋白质的浓度成正比

例如苄乙氯铵在碱性条件下

与蛋白质形成沉淀

可以在660nm处

进行浊度的测定

这些方法

由于分别可能在灵敏度

准确度 专一性 检测范围

或者是与不同种蛋白质的反应

一致性等某些方面

具有一定的局限性

现在已经在临床上

不常用于血清总蛋白的测定了

这节课主要介绍了

血清总蛋白检测的临床意义

和检测方法

其中双缩脲法是临床上

测定血清总蛋白时

首选的常规方法

好 这节课我们就先讲到这里

谢谢大家