当前课程知识点：药物分析 > 第五章 药物的含量测定 > 5.14 药品分析方法的验证（二） > 药品分析方法的验证（二）
大家好
上节课我们一起学习了
药品分析方法验证的基本内容
这次课我们将以具体案例
来学习如何开展药品分析方法的验证
本案例涉及到的药物为阿卡波糖
它是生物合成的假性四糖
临床常用于II型糖尿病的治疗
其具有极易溶于水
末端紫外吸收的特性
《中国药典》是采用了
高效液相色谱-紫外分光光度法
来测定阿卡波糖的含量
其色谱柱为氨基键合硅胶柱
检测波长为210 nm是末端检测
该方法存在灵敏度低
基线不稳、色谱柱柱效下降快
使用寿命短等不足
为了改善药典方法
赵慧等建立了以电喷雾检测器来
检测的高效液相色谱法测定
阿卡波糖胶囊含量的方法
该方法具有专属性强
灵敏度高、重现性好特点
实际样品用该方法测定的结果
与用药典收载的方法测定的结果相比
两者之间无显著性差异
且该方法与药典收载的方法相比
还具有分析时间短
需要样品量少、色谱峰形好等优势
那作者是如何按照
《药品分析方法验证指导原则》
进行方法验证呢
为了进行方法验证
作者首先制备了系列对照品溶液
供试品溶液和空白溶液
为了改善药典收载方法
所采用氨基柱的不足
作者采用了一特殊色谱柱
此色谱柱使用了化学稳定的
三键键合式的酰胺官能团柱
虽然其选择性与氨基柱相近
但此柱的pH耐受性非常强
即便是在极端pH条件下
柱子的耐受温度可达90℃
且此柱与氨基柱相比
其稳定性更高、寿命更长
非常适合于糖类物质的分析
为了考察色谱系统的适用性
作者首先进行系统适用性试验
色谱系统的适用性试验
通常包括理论板数
分离度、灵敏度、重复性
和拖尾因子五个参数
其中分离度和重复性尤为重要
在本案例中
作者是用规定的对照品溶液在规定的
色谱系统中进行上述5个指标的试验
试验结果可以发现理论板数
若以阿卡波糖的峰来计算
能超过5000
拖尾因子能小于1.2
且样品中的阿卡波糖能与
其他成分和辅料实现基线分离
分离度超过1.5
对测定无干扰
同时本方法的检测限为10 μg/ml
定量限为20 μg/ml
灵敏度也满足要求
色谱峰面积的相对标准偏差为0.64%
运小于2.0%的要求
重复性良好
根据上节课所学到的知识
我们知道验证药物含量测定方法时
需要对专属性、准确度、精密度
线性、范围和耐用性进行验证
那么我们来看看作者是
如何进行上述指标的验证呢
首先针对专属性的验证
按照要求是
若采用色谱法和其他分离方法时
应附上代表性的图谱
并应在色谱图中标明各成分的位置
且分离度应符合要求
用以说明方法的专属性
一般来说
若无法获得杂质或降解产物时
那就可用含有杂质或降解产物的
试样来验证专属性
当然也可以用与另一个经过验证了的
方法或药典方法进行比较来进行试验
还可用强光照射、高温、高湿
酸（碱）水解或氧化等
方法进行加速破坏
以研究可能存在的
降解产物对含量测定的影响
在本案例中
作者提供了色谱图图1
从图中可以看到溶剂
对阿卡波糖色谱峰无干扰
样品中其他成分和辅料对测定也无干扰
作者同时进行了酸、碱、氧化
高温、光照等破坏方法考察了专属性
结果可见
在各种破坏条件下所产生的杂质峰
均与阿卡波糖主峰达到了基线分离
对测定无干扰
表明该方法的专属性良好
针对准确度
一般是测定回收率
回收率的测定方法有
“回收试验法”和“加样回收试验法”
其中回收试验是在纯溶剂
或空白样品中加入已知量B的
对照品（或标准品）进行测定
而加样回收试验是在
已准确测定药物含量A的真实样品中
再加入已知量B的
对照品（或标准品）进行测定
在规定范围内
取同一浓度的供试品
用至少测定6份样品的结果进行评价
或设计3种不同浓度
每种浓度分别制备3份
供试品溶液进行测定
用9 份样品的测定结果进行评价
且浓度的设定应考虑
样品的实际浓度范围
在本案例中
作者是采用了加样回收试验法
进行了准确度的考察
具体是在已准确测定
药物含量A的真实样品中
分别加入低、中、高3个浓度
每个浓度平行3份样品
总计9份样品进行了加样回收率的测定
结果可见
回收率符合要求
针对精密度
按照要求
一般要进行重复性
中间精密度和重现性的考察
其中重复性是指在相同条件下
由同一个分析人员测定
所得结果的精密度
具体来说
是在规定浓度范围内
取同一浓度的供试品
用至少6份的测定结果进行评价
或者设计3种不同浓度
每种浓度分别制备3份
供试品溶液进行测定
用至少9份样品的测定结果进行评价
而中间精密度是指在
同一个实验室内的条件发生改变
如不同时间、不同分析人员
不同设备等测定结果之间的精密度
这是为了考察随机变动因素
对精密度的影响程度
那重现性呢
是指在不同实验室
测定结果之间的精密度
一般只有当方法要被
国家药品质量标准采用时
才需要进行重现性试验
具体到本案例
作者是采用同一浓度
6份样品的测定结果评价了精密度
针对线性和范围
按照要求是应在规定的
范围内测定线性关系
具体来说是可用
同一对照品贮备液经精密稀释
或分别精密称取对照品
制备一系列对照品溶液的方法进行测定
系列溶液至少不少于5种浓度
在本案例中
作者是用同一对照品贮备液
经过精密稀释后
制备了5份对照品溶液
进行了其线性和范围的测定
结果可见线性良好
范围满足实际样品测定的需求
针对耐用性
高效液相色谱法通常需要
对流动相的组成和pH值
不同品牌或不同批号的
同类型色谱柱
柱温、流速等典型变动因素进行考察
在本案例中
作者是通过在0、4、8、12小时
分别测定同一样品的
色谱峰面积的变化情况
考察了溶液的稳定性
通过改变流速、流动相比例及柱温后
观察了阿卡波糖的拖尾因子
及与可能存在杂质的分离度的影响
考察了方法的耐用性
结果可见该方法的耐用性良好
最后
作者还用经验证通过后的
方法对实际样品进行了测定
并把测定结果与《中国药典》所收载的
方法所测定的结果进行了比较
结果提示方法可行
至此
我们就学习完了
药品分析方法验证的所有内容
谢谢大家
-1.1 药物分析的性质与任务
-第一章单元测试
-2.1 中国药典（一）
--中国药典（一）
-2.2 中国药典（二）
--中国药典（二）
-2.3 中国药典（三）
--中国药典（三）
-2.4 国际药品标准
--国际药品标准
-2.5 药品检验与监督
--药品检验与监督
-2.6 药品检验工作的基本程序
-2.7 药品管理规范
--药品管理规范
-第二章单元测试
-3.1 物理常数测定法-熔点
-3.2 物理常数测定法-吸收系数
-3.3 物理常数测定法-比旋度
-3.4 化学鉴别法
--化学鉴别法
-3.5 光谱鉴别法
--光谱鉴别法
-3.6 色谱鉴别法
--色谱鉴别法
-第三章单元测试
-4.1 药物中杂质的来源及分类
-4.2 杂质的限量要求与计算
-4.3 一般杂质的检查（一）
-4.4 一般杂质的检查（二）
-4.5 一般杂质的检查（三）
-4.6 一般杂质的检查（四）
-4.7 特殊杂质的检查（一）
-4.8 特殊杂质的检查（二）
-第四章单元测试
-5.1 容量分析法-酸碱滴定法
--容量分析法-概述
-5.2 容量分析法-酸碱滴定法
-5.3 容量分析法-氧化还原滴定法
-5.4 容量分析法-非水溶液滴定法
-5.5 紫外-可见分光光度法——概述
-5.6 紫外-可见分光光度法——比色法
-5.7 紫外-可见分光光度法——计算分光光度法
-5.8 高效液相色谱法（一）
-5.9 高效液相色谱法（二）
-5.10 气相色谱法
-5.11 样品的前处理方法（一）
-5.12 样品的前处理方法（二）
-5.13 药品分析方法的验证（一）
-5.14 药品分析方法的验证（二）
-第五章单元测试
-6.1 苯巴比妥及其制剂的分析
-6.2 司可巴比妥钠及其制剂的分析
-6.3 阿司匹林及其制剂的分析
-6.4 盐酸普鲁卡因及其制剂的分析
-6.5 磺胺甲噁唑及其制剂的分析
-6.6 左氧氟沙星及其制剂的分析
-6.7 异烟肼及其制剂的分析
-6.8 硝苯地平及其制剂的分析
-6.9 盐酸氯丙嗪及其制剂的分析
-6.10 盐酸麻黄碱及其制剂的分析
-6.11 硫酸阿托品及其制剂的分析
-6.12 硫酸奎宁及其制剂的分析
-6.13 地塞米松磷酸钠及其制剂的分析
-6.14 黄体酮及其制剂的分析
-6.15 维生素 B1 及其制剂的分析
-6.16 维生素 C 及其制剂的分析
-6.17 青蒿素及其制剂的分析
-6.18 青霉素钠及其制剂的分析
-6.19 头孢丙烯及其制剂的分析
-6.20 硫酸链霉素及其制剂的分析
-6.21 硫酸庆大霉素及其制剂的分析
-6.22 盐酸四环素及其制剂的分析
-第六章单元测试
-7.1 代表性辅料分析（一）
-7.2 代表性辅料分析（二）
-第七章单元测试
-8.1 制剂分析及其特点
--制剂分析及其特点
-8.2 片剂分析
--片剂分析
-8.3 注射剂分析
--注射剂分析
-8.4 复方制剂分析
--复方制剂分析
-第八章单元测试
-9.1 中药分析及其特点
--中药分析及其特点
-9.2 中药分析中样品处理方法
-9.3 中药的鉴别（一）
--中药的鉴别（一）
-9.4 中药的鉴别（二）
--中药的鉴别（二）
-9.5 中药指纹图谱与特征图谱
-9.6 中药的检查（一）
--中药的检查（一）
-9.7 中药的检查（二）
--中药的检查（二）
-9.8 中药的含量测定（一）
-9.9 中药的含量测定（二）
-第九章单元测试
-10.1 生物药物分析的特点
-10.2 生化药物分析
--生化药物分析
-10.3 生物制品分析
--生物制品分析
-第十章单元测试
-11.1 体内药物分析概述
--体内药物分析概述
-11.2 常用体内生物样品的制备与贮存
-11.3 体内生物样品分析的前处理（一）
-11.4 体内生物样品分析的前处理（二）
-11.5 体内分析方法的建立
-11.6 体内药物分析方法的建立与验证（一）
-11.7 体内药物分析方法的建立与验证（二）
-11.8 体内药物分析方法的建立与验证（三）
-第十一章单元测试
