5.8 高效液相色谱法（一）在线视频

大家好

今天我们学习高效液相色谱法

在药物分析中的应用

高效液相色谱法系以

高压液体为流动相的色谱法

系采用高压输液泵将规定的

流动相泵入装有填充剂的色谱柱

对供试品进行分离测定的色谱方法

注入的供试品

由流动相带入色谱柱内

各组分在柱内被分离

并进入检测器检测

由积分仪或数据处理系统记录

和处理色谱信号

HPLC法同时具有分离、分析功能

是各国药典收载的方法中

应用最广的方法

具有专属性强、灵敏度高

高效能及分析速度快等优点

是药物制剂

多组分样品分析的首选方法

高效液相色谱仪由高压输液泵

进样器、色谱柱、检测器

积分仪或数据处理系统组成

色谱柱内径一般为2.1〜4. 6mm

填充剂粒径约为2〜10μm

超高效液相色谱仪是

耐超高压、小进样量

低死体积、高灵敏度检测的

高效液相色谱仪

适应小粒径（约2μm）填充剂

色谱法根据其分离原理分为

吸附色谱法、分配色谱法

离子交换色谱法与排阻色谱法等

其中分配色谱法最为常用

分配色谱法分为正相色谱法

反相色谱法、离子对色谱法

和离子抑制色谱法

正相色谱法

流动相极性小于固定相极性

固定相为极性键合相

流动相是非极性流动相

以烷烃（如正己烷）为底剂

加入适量的极性调整剂

用于分离溶于有机溶剂的

极性及中等极性的分子型物质

反相色谱法

流动相极性大于固定相极性

以极性或非极性键合相为固定相

采用强极性流动相

如甲醇—水、乙腈—水

用于分离非极性至中等极性的

各类分子型物质

我们知道 离子色谱法

是用于分离非极性至中等极性

各类分子型物质

在物质中 有有机酸 有机碱 盐

还有有机弱酸 有机弱碱

它们会电离 有机弱酸有机弱碱部分电离

有机酸碱盐完全电离

怎么办呢 有机弱酸有机弱碱部分电离

如果不让你电离 那就可以

所以就派生了离子抑制色谱法

它仍然是反向色谱法

在反相色谱法的流动相中

加入离子抑制剂

来抑制被测物的解离

常用的离子抑制剂有酸

碱或缓冲盐

用于分离有机弱酸、弱碱

分离有机弱酸加的抑制剂就是酸

分离有机弱碱就加碱也可以加缓冲盐

对于有机酸碱盐完全电离

那么也是派生了离子对色谱法

在反相色谱法的流动相中

加入离子对试剂

生成离子对就可以进行分析

分离碱类常用烷基磺酸（盐）

如己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠

十二烷基磺酸钠等

分析酸类常用烷基季铵盐

如磷酸四丁基铵等

在离子对色谱法中也要调节PH值

对于有机酸要加碱让它完全电离

对于有机碱要加酸让它完全电离

在高效液相色谱法中不外乎有这几种

色谱柱 里面装了固定相

再一个就是流动相检测器

首先来看色谱柱

HPLC的色谱柱有反相色谱柱

正相色谱柱、离子交换色谱柱

和手性分离色谱柱等

最常用的为反相色谱柱

反相色谱柱

以键合非极性基团的载体

为填充剂填充而成的色谱柱

常见的载体有硅胶

聚合物复合硅胶和聚合物等

常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶

就是我们常说的C18柱

辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶

其中十八烷基硅烷键合硅胶最为常用

正相色谱柱

用硅胶或键合极性基团的

硅胶填充而成的色谱柱

常见的填充剂有硅胶

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶

也可用作反相色谱

离子交换色谱柱

用离子交换填充剂填充而成的色谱柱

有阳离子交换色谱柱

和阴离子交换色谱柱

手性分离色谱柱

用手性填充剂填充而成的色谱柱

对映异构体的分离通常

使用手性分离色谱柱

USP色谱柱与我国色谱柱的

对比关系如下

L1柱就是C18柱

L3柱就是硅胶柱

L7就是C8 L8就是氨基柱

L10就是氰基柱

其他的可以通过查阅资料知道

色谱柱使用中要注意几个问题

色谱柱使用极限范围

pH值范围

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱

流动相pH值一般应在2～8之间

如果酸性太强或碱性太强

色谱柱就会遭到破坏

如果残余硅羟基已封闭的硅胶

聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱

可耐受更广泛pH值的流动相

所以有耐酸柱和耐碱柱 耐酸柱呢

适合于pH值小于2或大于8的流动相

但价格也比普通柱子相对高一些

有机相或水相的极限比例

如用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时

流动相中有机溶剂一般不低于5%

否则易导致柱效下降

色谱系统不稳定

色谱柱还有最大使用压力

柱温范围等

温度会影响分离效果

品种正文中未指明

色谱柱温度时系指室温

为改善分离效果

可适当提高色谱柱的温度

但一般不宜超过60℃

新柱子使用前应进行活化

避免压力和温度的

急剧变化及任何机械震动

不要频繁更换流动相组成

尤其是酸碱性差异较大的

流动相的变更会影响色谱柱的柱效

使用含有酸、碱、盐成分的流动相

要注意洗柱

在高效液相色谱中洗柱是很重要的步骤

柱子应保存在合适的溶剂中

所以洗柱大部分都是用甲醇来洗柱

用过酸碱盐流动相后先使用

水相比例大的流动相洗

再使用适当提高甲醇流动相来洗

最后使用甲醇 柱子就保存在甲醇中

固定相选择的依据

根据被分离物质的性质

选择合适的色谱柱

一般

绝大多数有机化合物的分析

选择C18 C8

苷和糖类的分析选择NH2

多双键化合物的分析选择CN

芳香化合物的分析选择Ph

强极性物质的分析选择Sil

手性化合物的分析选择手性柱

高效液相色谱仪的检测器有多种

分为选择性检测器

和通用型检测器两大类

紫外-可见分光检测器、荧光检测器

电化学检测器为选择性检测器

其响应值不仅与被测物质的量有关

还与其结构有关

蒸发光散射检测器、电雾式检测器

和示差折光检测器为通用检测器

对所有物质均有响应

结构相似的物质在蒸发光散射检测器

和电雾式检测器的响应值

几乎仅与被测物质的量有关

紫外-可见分光检测器

荧光检测器、电化学检测器

和示差折光检测器的响应值

与被测物质的量

在一定范围内呈线性关系

蒸发光散射检测器的响应值

与被测物质的量通常呈指数关系

一般需经对数转换

电雾式检测器的响应值与

被测物质的量通常也呈指数关系

一般需经对数转换或用二次函数计算

但在小质量范围内可基本呈线性

除了这两大检测器以外

还有更专属、更灵敏的检测器

质谱 LC-MS

在高效液相色谱中

最常用的检测器是

紫外-可见分光检测器

包括二极管阵列检测器

不同的检测器

对流动相的要求不同

紫外-可见分光检测器所用流动相

应符合紫外-可见分光光度法

通则0401项下对溶剂的要求

采用低波长检测时

还应考虑有机溶剂的截止使用波长

蒸发光散射检测器

电雾式检测器和质谱检测器

不得使用含不挥发性成分的流动相

反相色谱系统的流动相

常用甲醇-水系统和乙腈-水系统

用紫外末端波长检测时

宜选用乙腈-水系统

也可选择四氢呋喃-水等

流动相中应尽可能不用缓冲盐

如需用时

应尽可能使用低浓度缓冲盐

使用C18 柱时

流动相中有机溶剂的比例应不低于5%

正相色谱系统的流动相

常用两种或两种以上的有机溶剂

如二氯甲烷和正己烷等

流动相注入液相色谱仪的方式

（又称洗脱方式）可分为两种

一种是等度洗脱

另一种是梯度洗脱

用梯度洗脱分离时

梯度洗脱程序通常

以表格的形式在品种项下规定

其中包括运行时间和流动相

在不同时间的成分比例

在这些色谱参数中

哪些可以调整哪些不可以调整

调整的范围是怎么样的呢

在药典通则中规定

品种正文项下规定的色谱条件（参数）

除填充剂种类、流动相组分

检测器类型不得改变外

其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径

流动相流速、流动相组分比例

柱温、进样量、检测器灵敏度等

均可适当调整

药典通则0512规定了色谱参数调整范围

如流动相

等度洗脱

最小比例的流动相组分可在相对值

±30%或者绝对值±2%的范围内

进行调整（两者之间选择最大值）

最小比例流动相组分的比例

需小于（100/n ) %

n为流动相中组分的个数

梯度洗脱

可适当调整流动相组分比例

以保证系统适用性符合要求

并且最终流动相洗脱强度

不得弱于原梯度的洗脱强度

如检测波长

不允许改变

当耐用性试验证明必须使用特定品牌的

色谱柱方能满足分离要求时

可在该品种正文项下注明

调节流动相中有机溶剂比例

可调整被测物的保留时间

近似规则

流动相中有机溶剂降低10%

溶质的容量因子约增加3倍

40%甲醇的强度

约等于33%乙腈

约等于23%四氢呋喃

所以可以根据这样的规则

来调整流动相

最后我们用思维导图

对以上内容进行小结

希望大家课后及时复习

今天的课就上到这里

谢谢大家！