中药的含量测定（二）在线视频

大家好

今天以万氏牛黄清心丸为例

介绍一下如何建立中药含量测定方法

万氏牛黄清心丸我们在

中药分析的特点一节中讲述过

其处方由牛黄

黄连 黄芩等六味中药组成

其中牛黄 清心解毒

豁痰开窍 为君药

黄连 黄芩 栀子（清热泻火）为臣药

朱砂（清心安神）

郁金（行气开窍）为佐使药

六药合用可透邪泄热

开窍安神

方中牛黄既为君药

又为贵重药

在含量测定药味选择时为首选药味

同时

处方中黄连为用量最大的臣药

其基础研究非常清楚

有适宜的含量测定方法

也可以选择这个药味

值得注意的是

朱砂虽为佐使药

但是具有毒性

因此为了用药的安全性和有效性

必须规定其含量幅度范围

中国药典中

选择牛黄中胆红素

朱砂中硫化汞

黄连中小檗碱作为测定指标

采用HPLC法

容量分析法进行测定

并规定了上述成分的限幅度要求

我们以文献中万氏牛黄清心丸

(浓缩丸)中盐酸小檗碱的含量

测定方法建立为例介绍一下

如何开展HPLC测定中药

及其制剂中含量测定的研究工作

面对一个中药制剂的含量测定

我们首先就要面对

上节课提出的3个问题

测定什么成分

采用什么分析策略

用什么方法来测定

首先剖析第1个问题

测定什么成分

对于中药制剂

我们第一步要选定测定药味

万氏牛黄清心丸

中黄连为用量最大的臣药

且其基础研究非常清楚

有非常适宜的含量测定方法

因此我们可以选择

处方中黄连进行质量控制

接下来选择黄连中哪些成分进行评价呢

我们上节课在黄连药材的

一测多评法测定中提到过

黄连中主要有效成分是生物碱类成分

其中小檗碱含量高

为黄连主要有效成分

为药理作用与该药味

的功能主治相一致的成分

因此

我们可以选择测定小檗碱的含量

第2个问题

采用什么分析策略

处方中黄连药效明确

小檗碱含量较高

因此采用单一成分测定

第3个问题

用什么方法来测定

根据我们的测定对象

小檗碱是单一组分

可以选择色谱法进行含量测定

溶液的制备

首先

制备阴性对照样品

按照处方量及制法

制成缺味阴性对照样品

然后

制备供试品溶液

对照品溶液

阴性对照溶液

供试品溶液制备中

主要是根据生物碱的

溶解性质来选择提取溶剂

游离态的生物碱易溶于三氯甲烷

甲醇

乙醇等有机溶剂

结合态生物碱易溶于水

我们要分析的丸剂黄连中生物碱

同时以结合态和游离态存在

提取溶剂中加入盐酸

使结合态生物碱游离

再采用甲醇提取游离态生物碱

提取方法中

采用60℃水浴加热

使生物碱游离

再结合超声辅助提取和冷浸法

保证游离生物碱提取完全

我们在建立含量测定方法时

如何估算供试品取样量

以及对照品溶液浓度

我们可以来估算一下

根据处方量

黄连药材在1g制剂中约含0.33g

通过查阅《中国药典》和文献

黄连药材中含盐酸

小檗碱不得低于5.0%

我们按照5.0%进行估算

那么1g制剂中约

含盐酸小檗碱为16.9mg

我们考虑供试品的取样量

如果取1g的供试品进行含量测定

大约需要16.9mg的盐酸小檗碱对照品

那我们今天所介绍的文献

取约0.1g的供试品

定容于100ml量瓶中

每ml中含约含

盐酸小檗碱0.0169mg

制备对照品溶液时其浓度要与

供试品溶液中待测成分的浓度相当

为0.0256mg/ml

色谱条件与系统适用性试验

色谱柱采用十八烷基硅烷

键合硅胶为填充剂

流动相为乙腈 -0. 05% mol /L

磷酸二氢钾溶液（10%氢氧化钾溶液调 pH 5.0）（28∶72）

检测波长为 265nm

理论板数按盐酸小檗碱峰

计算应不低于 2000

方法建立过程中

我们需要根据实际情况调整色谱条件

进行色谱条件优化

从而确定最优的色谱条件

反相高效液相色谱法

测定生物碱类成分常采用离子抑制色谱

盐酸小檗碱含量测定

最常用的流动相为

乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液

经试验发现

该流动相测定万氏牛黄清心丸时

色谱图中主峰因峰

形不对称而与相邻峰难以完全分离

改用离子对色谱法

在流动相中加入阴离子型

表面活性剂十二烷基磺酸钠调整以后

峰形及分离度得到很大改善

但柱饱和时间太长

超过30个小时

继续调整流动相

在乙腈-0.05mol/L磷酸

二氢钾溶液中加入10%

氢氧化钾溶液调节pH至5.0后

峰形及分离度也得到很大改善

并且色谱柱在30～60min内即可被饱和

因此

该文献采用离子抑制色谱法

对处方中小檗碱进行分离分析

那么我接下来要进行方法学的验证

第一步专属性考察

色谱系统适用性试验 对照品溶液进样

理论板数

分离度

拖尾因子等进行考察

该方法要求理论板数

按盐酸小檗碱峰计算应不低于 2000

专属性 三张色谱图

阴性对照无干扰

表明方法专属性良好

方法学验证——线性关系考察

标准曲线 3～7个浓度

每个浓度进3针

中间浓度至少进5针

峰面积的RSD≤2.0%

根据方法需要

可进行检测限与定量限的测定

色谱系统适用性试验中的灵敏度

那么我们接下来进行稳定性试验

稳定性试验

考察供试品溶液放置稳定性

可取1份供试品提取测定

或用重复性试验第1份样品进行试验

至少5个时间点

至少12小时

峰面积的RSD≤2.0%

接下来进行 精密度试验

精密度试验 仪器的精密度

色谱系统适用性试验中的重复性

我们采用中浓度的对照品溶液

连续进样5次

用标准曲线中中间浓度点数据计算即可

峰面积的RSD≤2.0%

方法的精密度

我们用重复性试验进行验证

同一批号样品6份

每份进样2针

计算2针峰面积的平均值

以峰面积的平均值计算每份样品含量

6份含量平均作为该批号样品含量

同时报告RSD

含量的RSD根据含量确定

该制剂平均含量为27.04mg/g

RSD为1.13%

表明方法重复性良好

符合《中国药典》分析方法

验证指导原则的相关要求

最后我们要做加样回收试验

来确认方法的准确度试验

中药化学成分测定方法的准确度

可用已知纯度的对照品

进行加样回收率测定

即向已知被测成分含量的供试品

中再精密加入一定量的

已知纯度的被测成分对照品

依法测定

我们实际工作时

样品量为重复性试验样品量的一半

样品量×平均含量=供试品中待测成分量

计算出供试品中待测成分量（A）

取同一批号样品6份

每份样品中加入与供试品

中待测成分量接近1∶1的对照品（B）

一般这个对照品我们可以加入对照品溶液

按照供试品的提取方法提取样品

每份进样2针

计算2针峰面积的平均值

在加样回收试验中须注意

对照品的加入量与供试品

中被测成分含有量之和

必须在标准曲线线性范围之内

加入的对照品的量要适当

过小则引起较大的相对误差

过大则干扰成分相对减少

真实性差

用实测值与供试品中含有量之差

除以加入对照品量计算回收率

6份样品的回收率%计算平均回收率%

回收率的RSD根据含量确定

我们需要注意

稳定性试验

重复性试验

加样回收实验应用同一个批号的样品

最后来测定样品

该文献用同一厂家

3个批次的样品进行测定

结果含量平均值为28.80mg/g

最后用思维导图对中药含量测定进行小结

希望大家课后及时复习

并通过课后练习巩固知识点

取得更好的学习效果

今天的课就上到这里

下次课见

谢谢大家