当前课程知识点：药物分析 > 第十一章 体内药物分析 > 11.7 体内药物分析方法的建立与验证（二） > 体内药物分析方法的建立与验证（二）
大家好
今天我们通过实例继续学习
体内样品分析方法验证
苏特替尼为
小分子共价酪氨酸激酶抑制剂
通过共价修饰
EGFR 的 ATP 结合域
797 位半胱氨酸残基
阻断表皮生长因子
受体酪氨酸激酶的信号途径
抑制肿瘤细胞增殖
临床拟用于非小细胞肺癌的治疗
苏特替尼目前已完成Ⅰ期临床试验
尚无人体代谢和药动学相关报道
邱雅楠同学开展了
肿瘤患者血清中苏特替尼代谢产物
鉴定及药动学研究
我们以其毕业论文作为案例
以《液相色谱-串联质谱法
测定人血浆样品中苏特替尼浓度》
阐述方法学验证的主要思路及要求
方法学验证需配制
合适浓度的待测物储备液
（储备液的浓度可通过预实验确定）
标准系列工作溶液
定量下限和质控工作溶液
其中标准系列工作溶液
和质控工作溶液应用不同储备液配制
以便互相验证
保证结果的可靠性
因此配制苏特替尼对照品储备液2份
一份用于配制系列标准工作溶液
另一份用于配制质控（QC）溶液
另外还要配制内标储备液及工作溶液
一般内标只要配制一个浓度即可
该浓度的信号
应与标准曲线的中间浓度接近
以 d6-苏特替尼为内标
配制内标储备液和内标工作溶液
用人空白混合血浆（抗凝剂：EDTA）
以 1:20 的比例分别稀释配制标准
系列工作溶液及质控工作溶液
得到苏特替尼的系列校正标样（8个）
以及定量下限质控样品
和低
中
高三个浓度的质控样品
低浓度在定量下限的三倍以内
高浓度在定量上限的75%左右
注意
以上溶液及样品配制过程中
所用容量瓶及移液器均经过校正
制备好的各溶液
置 4℃ 冰箱内保存备用
血浆样品进行分装
置-70℃ 冰箱内保存备用
经过优化
确定最佳色谱条件和质谱条件如下
采用MRM多扫描模式
专属性强
灵敏度高
是液质联用中常用的定量模式
如何确定扫描离子对是关键
一般我们会选择分子离子作为母离子
另取稳定的相对丰度
最大的碎片离子作为子离子
在正离子检测模式下
苏特替尼的扫描离子对
是 m/z440.2→ m/z367.1
内标d6-苏特替尼的扫描离子对
m/z446.2 →m/z367.1
选用稳定同位素标记物 d6-苏特替尼
作为内标
可以大大降低基质效应
提高方法的准确性
样品前处理方法为
100μL人血浆样品
加入20μL内标
及300μL乙腈沉淀蛋白后
在4℃
3700rpm离心 15 min后
取上清液 1.00 μL
进行 LC-MS/MS 分析
方法学验证的第一指标为选择性
选择性考察内源性物质
代谢产物及同服药物的干扰
方法与要求为
使用至少6个受试者的适宜的空白基质
来证明选择性
（动物空白基质可以不同批次混合）
它们被分别分析并评价干扰
干扰组分的响应应低于
分析物定量下限响应的20%
并低于内标响应的5%
本案例中
取自6个不同个体的人空白血浆
人空白血浆+内标20.0 ng·mL-1
制备零浓度样品
人空白血浆+苏特替尼 0.50 ng·mL-1
+内标20.0 ng/mL-1制备
定量下限的质控样品
受试者口服
100 mg 苏特替尼后
2.0 h 血浆样品
取这四个样品照拟定方法测定
所得结果如图所示
人空白血浆中苏特替尼
保留时间处的响应
不高于定量下限响应的 20%
内标保留时间处的响应
不高于内标响应的 5%
结果表明
本方法测定人血浆中的苏特替尼的
选择性良好
残留的验证方法为
通过注射高浓度样品或校正标样后
注射空白样品来估计
要求
高浓度样品之后在空白样品中的残留
应不超过定量下限的20%
并且不超过内标的5%
如果残留不可避免
应考虑特殊措施
如在高浓度样品后注射空白样品
然后再分析下一个试验样品
以确保不影响准确度和精密度
本案例中
苏特替尼和内标的残留百分比
分别为1.8~8.5%
和0.0~0.1%均小于规定值
不存在残留
提取回收率试验可以来
评价样品预处理方法的可行性
具体测定法为
空白生物基质
+已知量待测物对照标准物质
制备高
中
低3个浓度的QC样品
每一浓度至少5个样品
每一样品进样
测定峰面积（B）
另取空白生物基质
照QC样品处理后
加入对照标准物质使浓度
与QC样品一致
进样
测定峰面积（A）
提取回收率=B/A×100%
要求：提取回收率≥50%
且重复性好
本案例中苏特替尼在低
中
高浓度的回收率分别为 90.9%
95.2%和90.5%
相对标准偏差小于 2.8%
提取回收率高且重复性良好
定量下限的要求为：取定量下限样品
按“准确度和精密度”项下方法测定
计算该浓度点批内
和批间的精密度及准确度
要求均在 ±20% 之内
本案例中的定量下限血浆样品是
取苏特替尼信噪比为10时的质控样品
即血浆质量浓度为
0.50 ng·mL−1苏特替尼质控样品
平行制备6份样品
至少在 2 天进行
连续三个分析批的测定
根据每一批次的标准曲线计算
该批次该浓度点每一样本的浓度
并计算该浓度点每一分析批之间的
精密度和准确度及不同分析批之间的
精密度及准确度
要求在 ±20% 之内
精密度应该不超过20%
该浓度苏特替尼的
批内精密度 （RSD）为 8.6%
批间精密度（RSD）为 7.2%
相对误差（RE）为-1.4%
结果表明
本法测定人血浆中苏特替尼的定量下限
可达 0.50 ng·mL-1
在进行分析方法验证之前
先根据预试验确定预期的浓度范围
标准曲线范围应该
尽量覆盖预期浓度范围
由定量下限和定量上限
（校正标样的最高浓度）来决定
该范围应该足够描述待测物的
完整药动学
在此范围内设计制备
不少于6个浓度的校正标样
并制备空白样品和零浓度样品
照拟定方法测定
以待测物和内标响应值的比值为
因变量（y）
待测物浓度
为自变量（x）进行线性回归分析
空白样品
零浓度样品不参与标准曲线计算
仅用于选择性的考察
回归方程的截距应接近0
相关系数应接近1
一般色谱法r≥0.99
取校正标样的信号比值代入
回归方程得各校正标样的回算浓度
计算回算浓度与标示浓度之间的偏差
以标准曲线参数和偏差评价标准曲线
校正标样回算的浓度
一般应该在标示值的±15%以内
定量下限处在±20%内
合格的标准曲线
应有至少75%校正标样
含最少6 个有效浓度的回算结果
满足上述标准
本案例用8个浓度点的校正标样
绘制的3条标准曲线均符合要求
如果8个浓度中
有1个浓度的回算结果不符合要求
那么应该拒绝这个浓度
取剩下7个浓度的校正标样
重新进行回归分析和评价
如果8个浓度中有3个浓度
不符合要求（只剩5个有效浓度
不符合最少6个有效浓度的要求）
则要重新进行标准曲线的验证
最后用思维导图对本节内容进行小结
希望大家课后及时复习
今天的课就上到这里
下节课见
谢谢大家
-1.1 药物分析的性质与任务
-第一章单元测试
-2.1 中国药典（一）
--中国药典（一）
-2.2 中国药典（二）
--中国药典（二）
-2.3 中国药典（三）
--中国药典（三）
-2.4 国际药品标准
--国际药品标准
-2.5 药品检验与监督
--药品检验与监督
-2.6 药品检验工作的基本程序
-2.7 药品管理规范
--药品管理规范
-第二章单元测试
-3.1 物理常数测定法-熔点
-3.2 物理常数测定法-吸收系数
-3.3 物理常数测定法-比旋度
-3.4 化学鉴别法
--化学鉴别法
-3.5 光谱鉴别法
--光谱鉴别法
-3.6 色谱鉴别法
--色谱鉴别法
-第三章单元测试
-4.1 药物中杂质的来源及分类
-4.2 杂质的限量要求与计算
-4.3 一般杂质的检查（一）
-4.4 一般杂质的检查（二）
-4.5 一般杂质的检查（三）
-4.6 一般杂质的检查（四）
-4.7 特殊杂质的检查（一）
-4.8 特殊杂质的检查（二）
-第四章单元测试
-5.1 容量分析法-酸碱滴定法
--容量分析法-概述
-5.2 容量分析法-酸碱滴定法
-5.3 容量分析法-氧化还原滴定法
-5.4 容量分析法-非水溶液滴定法
-5.5 紫外-可见分光光度法——概述
-5.6 紫外-可见分光光度法——比色法
-5.7 紫外-可见分光光度法——计算分光光度法
-5.8 高效液相色谱法（一）
-5.9 高效液相色谱法（二）
-5.10 气相色谱法
-5.11 样品的前处理方法（一）
-5.12 样品的前处理方法（二）
-5.13 药品分析方法的验证（一）
-5.14 药品分析方法的验证（二）
-第五章单元测试
-6.1 苯巴比妥及其制剂的分析
-6.2 司可巴比妥钠及其制剂的分析
-6.3 阿司匹林及其制剂的分析
-6.4 盐酸普鲁卡因及其制剂的分析
-6.5 磺胺甲噁唑及其制剂的分析
-6.6 左氧氟沙星及其制剂的分析
-6.7 异烟肼及其制剂的分析
-6.8 硝苯地平及其制剂的分析
-6.9 盐酸氯丙嗪及其制剂的分析
-6.10 盐酸麻黄碱及其制剂的分析
-6.11 硫酸阿托品及其制剂的分析
-6.12 硫酸奎宁及其制剂的分析
-6.13 地塞米松磷酸钠及其制剂的分析
-6.14 黄体酮及其制剂的分析
-6.15 维生素 B1 及其制剂的分析
-6.16 维生素 C 及其制剂的分析
-6.17 青蒿素及其制剂的分析
-6.18 青霉素钠及其制剂的分析
-6.19 头孢丙烯及其制剂的分析
-6.20 硫酸链霉素及其制剂的分析
-6.21 硫酸庆大霉素及其制剂的分析
-6.22 盐酸四环素及其制剂的分析
-第六章单元测试
-7.1 代表性辅料分析（一）
-7.2 代表性辅料分析（二）
-第七章单元测试
-8.1 制剂分析及其特点
--制剂分析及其特点
-8.2 片剂分析
--片剂分析
-8.3 注射剂分析
--注射剂分析
-8.4 复方制剂分析
--复方制剂分析
-第八章单元测试
-9.1 中药分析及其特点
--中药分析及其特点
-9.2 中药分析中样品处理方法
-9.3 中药的鉴别（一）
--中药的鉴别（一）
-9.4 中药的鉴别（二）
--中药的鉴别（二）
-9.5 中药指纹图谱与特征图谱
-9.6 中药的检查（一）
--中药的检查（一）
-9.7 中药的检查（二）
--中药的检查（二）
-9.8 中药的含量测定（一）
-9.9 中药的含量测定（二）
-第九章单元测试
-10.1 生物药物分析的特点
-10.2 生化药物分析
--生化药物分析
-10.3 生物制品分析
--生物制品分析
-第十章单元测试
-11.1 体内药物分析概述
--体内药物分析概述
-11.2 常用体内生物样品的制备与贮存
-11.3 体内生物样品分析的前处理（一）
-11.4 体内生物样品分析的前处理（二）
-11.5 体内分析方法的建立
-11.6 体内药物分析方法的建立与验证（一）
-11.7 体内药物分析方法的建立与验证（二）
-11.8 体内药物分析方法的建立与验证（三）
-第十一章单元测试