紫外-可见分光光度法——概述在线视频

大家好

紫外-可见分光光度法

是在药物含量测定中应用较广的

仪器分析方法之一

今天我们学习

紫外可见-分光光度法的基本内容

紫外-可见分光光度法是在

190～800nm波长范围内

测定物质的吸光度

用于药物的鉴别

检查和含量测定的方法

波长为190～400 nm为紫外光区

波长为400～800nm为可见光区

朗伯-比耳定律是

分光光度法的基本定律

单色光辐射穿过被测物质溶液

在一定的浓度范围内被测物质吸收的量

与该物质的浓度和液层的厚度成正比

也就是A=Ecl

在这个公式中

A为吸光度

C为溶液浓度

而且是百分浓度

即每100 ml溶液中

所含被测物质的重量

这一点大家一定要关注

l为液层厚度

E为吸收系数

ChP用百分吸收系数表示

其物理意义为当溶液浓度为1%（g/m1）

液层厚度为1 cm时的吸光度

紫外-可见分光光度计由光源

单色器、吸收池、检测器

数据记录及处理系统构成

紫外-可见分光光度法

用于含量测定时

为保证测量的准确度和精密度

紫外-可见分光光度计

应定期进行全面校正和检定

检定的项目为波长

吸光度的准确度 杂散光

为什么要进行波长校正呢

由于环境因素对机械部分的影响

仪器的波长经常会略有变动

因此除应定期对所用的

仪器进行全面校正检定外

还应于测定前校正测定波长

常用汞灯、氘灯、钬玻璃进行校正

近年常使用高氯酸钬溶液

校正双光束仪器

仪器波长的允许误差为

紫外光区±1 nm

500 nm附近±2 nm

二 吸光度的准确度

吸光度的准确度可用

重铬酸钾的硫酸溶液检定

配制规定浓度的重铬酸钾硫酸溶液

在规定的波长处测定并计算其吸收系数

与规定的吸收系数比较

应符合规定

三 杂散光的检查

杂散光是一些不在谱带范围内

且与所需波长相隔较远的光

一般来源于光学仪器表面的瑕疵

所以要进行杂散光检查

杂散光的检查可配制规定浓度

碘化钠溶液和亚硝酸钠溶液

置1cm石英吸收池中

在规定的波长处测定透光率

结果应符合规定

进行测定时

测定的是被测物的溶液

要拿适当的溶剂

来溶解样品配制溶液

供试品配成溶液后测定吸光度

那么就要用到溶剂

对溶剂的要求是

必须能充分溶解样品

与样品无相互作用 挥发性小

除此之外

在测定波长处溶剂的

吸光度也应符合要求

使用范围均不能小于截止使用波长

例如甲醇、乙醇的

截止使用波长为205 nm

乙腈的截止使用波长为190nm

因此

在测定供试品前

应先检查所用溶剂是否符合要求

它的方法是将溶剂置

1 cm 石英吸收池中

以空气为空白测定其吸光度

看看吸光度是否符合要求

供试品溶液测定时

为提高测定方法的灵敏度

减少测定误差

一般在最大吸收波长

λmax处测定吸光度

在紫外分光光度法测定时

首先要进行波长确证

怎么样进行波长确证呢

就是以配制供试品溶液的

同批溶剂为空白对照

采用1cm的石英吸收池

在规定的吸收峰波长±2 nm

以内测试几个点的吸光度

或由仪器在规定波长附近自动扫描测定

除另有规定外

吸收峰波长应在该品种项下规定的

波长±2 nm以内

并以吸光度最大的波长作为测定波长

比如在药典中

某一物质测定波长为247.2nm

配好溶液后第一个步骤先做波长确证

看一看样品最大吸收波长

在不在247.2nm±2nm范围内

如果在 波长确证没有问题

而且以所选最大吸收波长作为测定波长

比如所选最大波长为247.2nm

那么测定时就是247.2nm

比如另一个是246.9nm

那么测定时就是246.9nm

所以同一试验所选的最大吸收波长不一样

所以测定波长也不一样

那么测定时都有空白对照

一般以配制供试品溶液的

同批溶剂为空白

那么在测定方法中有一个方法叫比色法

比色法所用的空白系指用同体积的

溶剂代替对照品或供试品溶液

然后依次加入等量的相应试剂

并用同样方法处理制成

也就是溶剂加了试剂来做空白

那我们知道 在紫外分光光度法中

A=0.434时 误差最小

所以 一般供试品溶液的吸光度读数

以在0.3～0.7之间的误差较小

因此应根据药物的吸收系数

将样品溶液配制为适宜的浓度

使吸光度在0.3-0.7之间

四 仪器的狭缝宽度

仪器的狭缝宽度越宽

光的单射性越弱

仪器的狭缝波带宽度应小于

供试品吸收带的半高宽度的十分之一

否则测得的吸光度会偏低

那怎么样来做呢

应以减小狭缝宽度时供试品的

吸光度不再增大为准

仪器的狭缝宽度就合适了

当溶液的pH 值对测定结果有影响时

应将供试品溶液的 pH 值

和对照品溶液的 pH 值调成一致

才能保证结果准确性

紫外-可见分光光度法

在含量测定中的应用时

有如下方法

一 吸收系数法

已知该品种在规定条件下的吸收系数

按各品种项下的方法配制供试品溶液

在规定的波长处测定其吸光度

吸收系数计算供试品的浓度

A=E_1cm^(1%) cl

c(g⁄(100ml)=A/(E_1cm^(1%) l))

所以我们这个浓度是g/100ml

在讲体积的时候 不会说这个溶液是

两个100ml 会说是200ml

所以把这个浓度化成

每毫升多少克

所以c(g⁄(ml)=A/(E_1cm^(1%) l×100))

本法的优点是不需要对照品

非常简便 配好溶液在规定波长测吸光度

简便、快速

但不能消除仪器、操作人员

操作时间等不同所带来的误差

且仪器的精度对测定结果有较大影响

因此用本法测定时

吸收系数通常应大于 100

并注意仪器的校正和检定

二 对照品比较法

那么用吸收系数法时有人为因素影响

对照品比较法就可以消除这些影响

是怎么样做的呢

配制对照品溶液

在规定的波长处测定供试品溶液

和对照品溶液的吸光度后

通过推导可知

吸光度之比等于浓度之比

供试品中被测溶液浓度就可以求算出来

即c_X=c_R×A_X/A_R

使用对照比较法时注意以下几点

一 对照品溶液中被测成分的量应为

供试品溶液中被测成分规定量的

100%±10%

也就是说 对照品溶液浓度

要尽可能和供试品溶液浓度接近

吸光度接近 误差最小

二 所用溶剂应完全一致

三 测定条件应完全一致

因为在推导过程中

认为吸收系数是一致的

当溶剂 测定条件完全一致系数才完全一致

这时公式才能推导出来

这时对照品比较法要注意的

本法的优点是可以消除仪器

操作人员、操作时间等

不同所带来的误差

亦可消除不同实验室之间的测量误差

但要求有对照品

在高效液相这些色谱方法没有之前

遇到了一个混合物测定

且两个物质都有吸收

我们知道吸光度具有加和性

那如何进行两个组分中

一个组分的测定呢

所以就应运而生了

三 计算分光光度法

计算分光光度法为解决

混合物的分析而产生

有多种计算分光光度法

如差示分光光度法、双波长分光光度法

导数分光光度法、正交函数分光光度法

褶合光谱法等

但是

计算分光光度法测定时

很多时候所选的波长

不是最大吸收波长

当吸光度处在吸收曲线的

陡然上升或下降的部位测定

波长的微小变化可能

对测定结果造成显著影响

所以目前

我们拥有更好的

同时具有分离分析功能色谱法

所以计算分光光度法逐渐退出历史舞台

而且在药典中规定

计算分光光度法一般不宜用作含量测定

所以保留的只有少数几个

四 比色法

供试品本身在

紫外-可见光区没有强吸收

或在紫外光区虽有吸收

但为了避免干扰或提高灵敏度

可加入适当显色剂

使反应产物的最大吸收移至

可见光区后测定

再进行测定

这种方法称为比色法

用比色法测定时

应用对照品比较法或标准曲线法定量

比色法所用的空白系指用同体积的

溶剂代替对照品或供试品溶液

然后依次加入等量的相应试剂

并用同样方法处理

原料药含量%的计算

紫外-可见分光光度法中一般取样品W

配制Vml溶液

取V1ml稀释至V2ml

测定V2溶液的吸光度

那么测了吸光度后就可计算浓度

c(g⁄(ml)=A/(E_1cm^(1%) l×100))

浓度是V2溶液的

如何换算成V1的呢

显然是乘以V2

除以V1 就是V1溶液浓度

那么想一想V1和V2浓度是不是一样呢

当然一样

因为V1是取V一定量出来的

所以V毫升溶液浓度为

V2:V1用D来表示

他是从V1稀释到V2

所以把D成为稀释倍数

所以V2浓度为C乘D即为浓溶液浓度

浓溶液浓度乘上体积

就是质量除以取样量乘100%

即为百分含量

所以吸收系数法公式为

那么同理在用对照品比较法时

百分比计算公式就变为

最后我们用思维导图

对该节内容进行小结

希望大家课后及时复习

今天的课就上到这里

谢谢大家！