当前课程知识点：药物分析 > 第十一章 体内药物分析 > 11.4 体内生物样品分析的前处理（二） > 体内生物样品分析的前处理（二）
大家好
今天我们继续学习
体内生物样品的前处理
生物样品在经过缀合物水解
或去除蛋白质后
如浓度较高
所选检测方法选择性好、灵敏度高
可直接进行测定
如浓度较低
或选择方法灵敏度不够高
或分析方法选择性不强时
则需进一步的分离 纯化与浓集处理
分离 纯化的方法主要有
液-液萃取法和液-固提取法
液-液萃取法是利用待测药物与内源性
干扰物质在有机溶剂中溶解度的
不同而进行分离的方法
多数药物是亲脂性的
而大多数内源性干扰物质是
强极性的水溶性物质
有机溶剂提取后可除去
大部分内源性干扰物质
有机溶剂萃取是液-液萃取的关键步骤
需解决2个关键问题
一是提取选择性
要求具有足够的提取效率
可通过萃取条件的优化获得
二是提取率的重现性
而有机溶剂的种类 用量
和提取方法的优化是解决问题的关键
选择溶剂时应根据药物
与溶剂的化学结构及其性质
按照相似相溶原理进行选用
要求
一 对被测组分溶解度大
二 沸点低 易挥发
三 与水不相混溶
四 无毒 不易燃烧
五 具有较高的化学稳定性和惰性
六 不影响待测成分的检测等
最常用乙醚 三氯甲烷
有机溶剂的用量
一般有机相与水相（体液样品）
体积比为1:1～5:1
有机溶剂的种类和用量的选择
可根据待测药物的性质
和分析方法的需要
经提取回收率试验进行优化
弱酸弱碱类药物以分子形式
存在时才易被有机溶剂提取
因此水相pH的选择
主要由药物的pKa确定
一般来说
碱性药物在碱性pH介质中萃取
最佳pH值要高于
药物pKa值1~2个pH单位
酸性药物在酸性pH介质中萃取
最佳pH值要低于
药物pKa值1~2个pH单位
对于在碱性pH不稳定的药物
可在近中性pH条件下
用三氯甲烷或异丙醇萃取
而中性药物在pH 7附近萃取
但由于多数药物是亲脂性的碱性物质
而生物样品中的内源性物质多是酸性的
所以在满足提取率要求的前提下
以偏碱性的pH值条件下提取
可降低内源性物质干扰
由图可见
空白血清提取物在pH13的
条件下出现的杂质峰最少
提取时采用缓冲溶液
保持溶液pH值稳定
可维持提取率的重现性
萃取时于水相（体液样品）中
加入有机溶剂后
一般只萃取一次（体外至少提取4次）
个别情况下（如杂质不易除去）
可进行反提操作
即将第一次萃取分离出的含药有机相
再用一定pH的水溶液反萃取回水相
然后再从水相将药物萃取到有机相
两性药物 高度电离的强极性药物
如季铵盐 羧酸类药物
在水相中以完全电离形式存在
难以用有机溶剂提取
可采用离子对提取法
类似于离子对色谱法
离子对萃取的基本原理是
带电荷的化合物Q+
当加入反离子X-于水相时
形成脂溶性的离子对QX
可被有机溶剂提取
常用反离子
碱性药物——用烷基
或芳基磺酸盐 如庚烷磺酸钠等
无机酸根（ClO4－, Cl－ ）
磺酸 硫酸 羧酸类药物或葡萄糖醛酸苷
用4~12个C的烷基铵如四丁基铵等
常用提取溶剂
三氯甲烷 二氯甲烷
因为这两种溶剂对离子对提取效率很高
离子对提取法对水相PH值要求很高
水相pH
应使药物完全解离
与反离子完全反应
液-固提取法又称固相萃取法
是规模缩小的柱色谱法
是将不同填料作为固定相填入小柱
当生物样品溶液通过时
由于受到吸附 分配
离子交换或其他作用
药物或杂质保留在固定相上
用适当溶剂洗去杂质
再用适当溶剂将药物洗脱下来
反相SPE柱的固定相为烷基键合硅胶
苯基键合硅胶或氰基键合硅胶
其中十八烷基硅烷键合相硅胶
简称C18 最常用
正相SPE柱的固定相为氧化铝 硅胶
聚酰胺 硅藻土 活性炭等
离子交换树脂柱常用聚苯乙烯
二乙烯基苯类树脂为基质材料
应根据被测物的理化性质
选择填料的种类
根据被测物含量的多少来选择填料量
根据样品溶液的体积来选择柱体积
对于非离子型物质而言
弱极性或非极性化合物选用
C18 C8 等反相固相萃取柱
极性较强的则使用氧化铝 硅胶
聚酰胺 硅藻土等正相固相萃取柱
强离子型分析物则采用
离子交换固相萃取柱
对于某些弱酸或弱碱性化合物
通过调节缓冲液的pH
采用C18等非离子型键合相
也可获得理想的萃取效率
填料量 0.1~0.5g
被萃取物的量不应超过填料量的5%
柱体积 1～5ml
商品固相萃取小柱有子弹型和针筒型
SPE的操作通常包括柱活化
加样 淋洗 洗脱四个步骤
柱活化
其目的是对柱中的固定相溶剂化
以应用最多的反相柱为例
使用前用6~10倍量体积的
甲醇或乙腈通过小柱
以湿润固相填料
使其溶剂化
然后用6~10倍量体积的水
或缓冲液冲洗
以除去甲醇或乙腈
使其达到良好的分离状态
正相柱通常用溶解样品的
有机溶剂预处理
离子交换柱一般用水或弱缓冲剂预处理
加样
将样品液加到柱子上
用真空或加压
让样品溶液缓缓通过萃取管
淋洗
用适当溶剂（一个管体积）洗涤
使感兴趣化合物保留在柱上
洗除杂质
达到净化目的
然后通氮气干燥固相柱
洗脱
根据被测物性质选择合适的
溶剂将样品组分洗脱
调整洗脱溶剂的pH值和极性
用强洗脱能力的溶剂
使待测物从柱上解析
应注意
一 根据被测物理化性质
供试样品体积大小
含量多少选择SPE柱
防止过载 导致样品流失
二 加样时
调节样品过柱流速
一般控制在0.2~1 ml/min
流速过快
会造成样品中的药物损失
三 洗脱时
用两次少量液体洗脱比
用一次大量体积洗脱更有效
每次洗脱液停留在管填料上
以20s～1min为最好
此时回收率高
这一步要求慢速
流速要控制在0.2~1ml/min
样品在提取过程中
虽然被测组分得到了纯化
但因微量的组分分布在
较大体积（数毫升）的提取溶剂中
常需要使被测组分浓集
以提高检测灵敏度
浓集的方法主要有两种
一种方法是在末次提取时
加入的提取液尽量少
使被测组分提取到小体积溶剂中
然后直接吸出适量供测定 达到浓集目的
另一种方法是挥去提取溶剂法
挥去溶剂时应避免直接加热
防止被测组分破坏或挥发损失
挥去提取溶剂的常用方法是
直接通入氮气流吹干
氮气适用于容易被氧化的药物
我们会选择氮气这一惰性气体
如果样品没问题可以用空气
对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物
可采用减压法挥去溶剂
化学衍生化是利用化学反应使样品中的
待测组分与衍生化试剂作用生成衍生物
使其更适应于特定的分析方法
药物分子中含有活泼氢者
均可被化学衍生化
如含有R-COOH R-OH R-NH2
R-NH-R′ 等官能团的药物
都可进行衍生化
GC法中衍生化的目的为
增加药物的稳定性
提高药物的挥发性
或提高对光学异构体的分离能力
方法有硅烷化 酰化
烷基化 不对称衍生化等
HPLC法中衍生化的
目的为提高检测灵敏度
改善色谱分离效果
分为在线衍生化 离线衍生化
根据衍生化是在分离前还是分离后可分为
柱前衍生化和柱后衍生化
方法有紫外衍生化 荧光衍生化
电化学衍生化 质谱衍生化
和非对映衍生化等
最后用思维导图对本节内容进行小结
希望大家课后及时复习
今天的课就上到这里
下节课见
谢谢大家！
-1.1 药物分析的性质与任务
-第一章单元测试
-2.1 中国药典（一）
--中国药典（一）
-2.2 中国药典（二）
--中国药典（二）
-2.3 中国药典（三）
--中国药典（三）
-2.4 国际药品标准
--国际药品标准
-2.5 药品检验与监督
--药品检验与监督
-2.6 药品检验工作的基本程序
-2.7 药品管理规范
--药品管理规范
-第二章单元测试
-3.1 物理常数测定法-熔点
-3.2 物理常数测定法-吸收系数
-3.3 物理常数测定法-比旋度
-3.4 化学鉴别法
--化学鉴别法
-3.5 光谱鉴别法
--光谱鉴别法
-3.6 色谱鉴别法
--色谱鉴别法
-第三章单元测试
-4.1 药物中杂质的来源及分类
-4.2 杂质的限量要求与计算
-4.3 一般杂质的检查（一）
-4.4 一般杂质的检查（二）
-4.5 一般杂质的检查（三）
-4.6 一般杂质的检查（四）
-4.7 特殊杂质的检查（一）
-4.8 特殊杂质的检查（二）
-第四章单元测试
-5.1 容量分析法-酸碱滴定法
--容量分析法-概述
-5.2 容量分析法-酸碱滴定法
-5.3 容量分析法-氧化还原滴定法
-5.4 容量分析法-非水溶液滴定法
-5.5 紫外-可见分光光度法——概述
-5.6 紫外-可见分光光度法——比色法
-5.7 紫外-可见分光光度法——计算分光光度法
-5.8 高效液相色谱法（一）
-5.9 高效液相色谱法（二）
-5.10 气相色谱法
-5.11 样品的前处理方法（一）
-5.12 样品的前处理方法（二）
-5.13 药品分析方法的验证（一）
-5.14 药品分析方法的验证（二）
-第五章单元测试
-6.1 苯巴比妥及其制剂的分析
-6.2 司可巴比妥钠及其制剂的分析
-6.3 阿司匹林及其制剂的分析
-6.4 盐酸普鲁卡因及其制剂的分析
-6.5 磺胺甲噁唑及其制剂的分析
-6.6 左氧氟沙星及其制剂的分析
-6.7 异烟肼及其制剂的分析
-6.8 硝苯地平及其制剂的分析
-6.9 盐酸氯丙嗪及其制剂的分析
-6.10 盐酸麻黄碱及其制剂的分析
-6.11 硫酸阿托品及其制剂的分析
-6.12 硫酸奎宁及其制剂的分析
-6.13 地塞米松磷酸钠及其制剂的分析
-6.14 黄体酮及其制剂的分析
-6.15 维生素 B1 及其制剂的分析
-6.16 维生素 C 及其制剂的分析
-6.17 青蒿素及其制剂的分析
-6.18 青霉素钠及其制剂的分析
-6.19 头孢丙烯及其制剂的分析
-6.20 硫酸链霉素及其制剂的分析
-6.21 硫酸庆大霉素及其制剂的分析
-6.22 盐酸四环素及其制剂的分析
-第六章单元测试
-7.1 代表性辅料分析（一）
-7.2 代表性辅料分析（二）
-第七章单元测试
-8.1 制剂分析及其特点
--制剂分析及其特点
-8.2 片剂分析
--片剂分析
-8.3 注射剂分析
--注射剂分析
-8.4 复方制剂分析
--复方制剂分析
-第八章单元测试
-9.1 中药分析及其特点
--中药分析及其特点
-9.2 中药分析中样品处理方法
-9.3 中药的鉴别（一）
--中药的鉴别（一）
-9.4 中药的鉴别（二）
--中药的鉴别（二）
-9.5 中药指纹图谱与特征图谱
-9.6 中药的检查（一）
--中药的检查（一）
-9.7 中药的检查（二）
--中药的检查（二）
-9.8 中药的含量测定（一）
-9.9 中药的含量测定（二）
-第九章单元测试
-10.1 生物药物分析的特点
-10.2 生化药物分析
--生化药物分析
-10.3 生物制品分析
--生物制品分析
-第十章单元测试
-11.1 体内药物分析概述
--体内药物分析概述
-11.2 常用体内生物样品的制备与贮存
-11.3 体内生物样品分析的前处理（一）
-11.4 体内生物样品分析的前处理（二）
-11.5 体内分析方法的建立
-11.6 体内药物分析方法的建立与验证（一）
-11.7 体内药物分析方法的建立与验证（二）
-11.8 体内药物分析方法的建立与验证（三）
-第十一章单元测试
