5.6 紫外-可见分光光度法——比色法在线视频

大家好

今天我们学习比色法

在药物分析中的应用

首先我们学习酸性染料比色法

酸性染料比色法是

利用在一定pH条件下

一些酸性染料可与有机碱类药物

定量结合显色来测定药物含量

因为试剂是酸性染料

所以我们把它叫做酸性染料比色法

其原理为

在适当pH值的水溶液中

有机碱类药物（B）可与

氢离子结合成阳离子（BH+）

一些酸性染料可解离成阴离子（In-）

上述阳离子与阴离子在同一溶液中

能定量结合生成电中性的

有色离子对（BH+·In-）

那离子对有什么性质呢

该离子对不溶于水

溶解于有机溶剂形成有色溶液

可以被有机溶剂定量萃取

在一定波长处测定有机溶剂中

离子对的吸光度

对照品比较法定量

即可计算有机碱类药物的含量

酸性染料比色法测定有机碱类药物

含量的关键是离子对的

定量形成与定量萃取

水相的pH值 有机碱的性质

酸性染料的种类 有机溶剂的种类等

是影响酸性染料比色法的重要因素

一 水相pH值的选择

在影响酸性染料比色法的因素中

水相pH值最为重要

如果pH值过低

H+浓度高

抑制酸性染料的离解

所以酸性染料基本以分子形式存在

使In-浓度过低

没有阴离子只有阳离子形不成离子对

如果pH值过高

H+浓度低

有机碱多呈游离状态

使BH+浓度过低

也影响离子对的形成

为了准确测定有机碱类药物的含量

水相的pH值应能使有机碱

定量形成阳离子（BH+）

酸性染料形成足够的阴离子（In-）

并定量生成溶于有机溶剂的离子对

一般可依据有机碱和酸性染料的

pKa值以及离子对在两相中的

分配系数进行确定pH值范围

然后通过试验确定水相最佳pH值

酸性染料的选择应符合以下条件

一 应能与有机碱定量结合

且生成的离子对在有机相中

有足够大的溶解度

二 生成的离子对在

最大吸收波长处有较高的吸光度

三 酸性染料在有机相中

应不溶或很少溶解

否则酸性染料在有机相中

有机相吸光度就会大大增加

可用于本法的酸性染料较多

常用磺酸酞类指示剂

包括溴麝香草酚蓝、溴酚蓝

溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲基橙等

溴麝香草酚蓝（BTB）与有机碱

生成的离子对具有极高的

有机溶剂提取常数（logK为8.0）

故被认为是最好的酸性染料

酸性染料选好后浓度怎么选呢

酸性染料的浓度对测定结果影响不大

有足够量即可

增加酸性染料的浓度

可以提高测定的灵敏度

但如果浓度太高

易产生严重的乳化层

所以要综合考虑

选择合适的酸性染料

三 有机溶剂的选择

有机溶剂的选择应符合以下条件

一 应与水不相混溶

二 具有高的离子对提取率

常用的有机溶剂有三氯甲烷

三氯甲烷能与离子对形成氢键

选择性好

在水中的溶解度小

且混溶的微量水分易于除去

是较理想的溶剂

最为常用

除三氯甲烷外还可以用二氯甲烷

二氯乙烯 乙醚等

如果有机相中有水分

有水分就可以把酸性染料带进去

使溶液吸光度大大增加

影响测定准确度 所以

用有机溶剂提取有色离子对时

应严防水分的混入

怎么防止混入呢 我们常

在有机相中加入脱水剂

或经干燥滤纸滤过

以除去其中的微量水分

在实验的时候

也可以用斩头去尾的方式

来分取我们的有机相

也就是说最开始一部分有机相不要

和水接触那一部分也不要

只保留中间部分

五 酸性染料中的有色杂质

如果混入有机相

将干扰测定

所以我们怎么办呢

可在加入供试品前

将缓冲液与酸性染料的混合液

用所选有机溶剂萃取弃去

以除去酸性染料中的有色杂质

该方法具有一定的专属性,灵敏度高

适用于小剂量有机碱类

药物制剂的含量测定

ChP硫酸阿托品片

硫酸阿托品注射液

氢溴酸山莨菪碱片

氢溴酸山莨菪碱注射液

采用本法测定含量

如硫酸阿托品注射液的含量测定

在pH约4.2溶液中

硫酸阿托品与溴甲酚绿生成离子对

用三氯甲烷萃取

分取三氯甲烷层

在420nm的波长处测定吸光度

对照品比较法定量

吩噻嗪类药物为吩噻嗪的衍生物

分子结构中均含有硫氮杂蒽母核

分子结构中的硫有两对孤对电子

在适当pH的溶液中

可与金属钯离子络合形成

有色的配位化合物

在500nm波长附近有最大吸收

因此 对于吩噻嗪类药物

可以用钯离子比色法进行测定

吩噻嗪的硫是-2价的硫

很容易被氧化

所以在吩噻嗪类药物中有

砜和亚砜这样的杂质

用钯离子比色法进行比色测定时

其氧化产物砜和亚砜则无此反应

只有吩噻嗪类药物反应

所以本法最大的优点是可选择性地

用于未被氧化的吩噻嗪类药物的测定

消除了本类药物中氧化产物的干扰

USP奋乃静糖浆的含量测定采用该法

ChP盐酸克仑特罗栓的含量测定

采用重氮化-偶合反应比色法

盐酸克仑特罗分子结构中有芳伯氨基

在盐酸酸性条件下与亚硝酸钠

反应生成重氮盐

重氮盐在酸性条件下

与盐酸萘乙二胺偶合显色

在500nm波长处有最大吸收

在500nm波长处测定吸光度

对照品比较法定量

这就是重氮化-偶合反应比色法

酸性基质比较复杂

为消除栓剂基质的影响

测定时

加三氯甲烷使栓剂基质溶解后

溶解后用盐酸溶液（9→100）

提取盐酸克仑特罗到水层

盐酸克仑特罗把它分到水层

分到水层后

提取液再发生重氮化偶合反应

再测定过程中注意一点

偶合试剂盐酸萘乙二胺

与亚硝酸反应也能显色

亚硝酸本来和药物反应

但偶合试剂也能和其反应并产生颜色

吸光度具有加和性 所以

干扰比色测定

所以在加了三氯甲烷再用盐酸萃取

萃取之后分取提取液

再加亚硝酸钠

等重氮化反应完全后

应先加氨基磺酸铵

将剩余的亚硝酸分解除去

再加盐酸萘乙二胺

甾体激素分为肾上腺皮质激素和性激素

肾上腺皮质激素的含量测定

可采用四氮唑比色法

肾上腺皮质激素结构中的

C17-α-醇酮基具有还原性

能在强碱性条件下将四氮唑盐

定量还原为有色产物

在一定波长处有最大吸收

可用比色法测定含量

所以叫四氮唑比色法

生成有色产物的颜色随

所用试剂和条件不同各异

常用四氮唑盐有两种

氯化三苯四氮唑

即红四氮唑

产物颜色是深红色三苯甲臜

在480~490nm有最大吸收

蓝四氮唑

可被还原为暗蓝色的双甲臜

在525nm左右有最大吸收

本法测定时受各种因素的影响

在操作中应严格控制实验条件

才能获得满意的结果

一 取代基的影响

肾上腺皮质激素类药物的

结构影响反应速率

一般为C11=O＞ C11－OH

C21－OH＞C21-酯

当酯化了的基团为三甲基醋酸酯

磷酸酯或琥珀酸酯时

反应更慢

四氮唑比色法在强碱条件下进行反应

目前最常用的碱为氢氧化四甲基铵

肾上腺皮质激素与氢氧化四甲基铵

长时间接触会发生分解

测定时应先加四氮唑盐后再加入碱液

该反应受水分影响大

含水量大时呈色速度减慢

所以采用无水乙醇为佳

乙醇很容易氧化成乙醛无水乙醇中

由于醛具有还原性

会消耗四氮唑盐

使吸光度增高

故规定采用无醛乙醇为溶剂

反应及产物对空气中的氧敏感

空气中的氧会影响呈色强度和稳定性

可加入试剂后往容器中充氮气来排空气

反应产物对光敏感

应用避光容器并置于暗处显色

测定吸光度速度要快

温度越高反应速度越快

但一般选择在常温下反应

ChP和BP采用红四氮唑为试剂

一般规定在25℃的

暗处反应40~45min

USP采用BT为试剂

一般规定在暗处反应90分钟

如醋酸去氧皮质酮的含量测定

以无醛乙醇为溶剂

加氯化三苯四氮唑试液

在氮气流下

迅速加入氢氧化四甲基铵试液

通氮气后

密塞

摇匀

在30℃水浴中放置1小时

迅速冷却

用无醛乙醇稀释至刻度

摇匀

来测定吸光度

具有Δ⁴-3-酮基的肾上腺皮质激素

雄性激素和蛋白同化激素

孕激素在酸性条件下与

羰基试剂异烟肼缩合成异烟腙

在一定波长下具有最大吸收

所以肾上腺皮质激素

雄性激素和蛋白同化激素

孕激素

可用异烟肼比色法测定含量

本方法主要对Δ⁴-3-酮基适用

以无水甲醇或无水乙醇为溶剂

反应应在酸性条件下进行

一般采用盐酸

当酸与异烟肼的摩尔比为2∶1时

可获得最大的吸光度

温度升高

反应速度加快

反应应在一定温度下的水浴中进行

ChP2005中

倍他米松磷酸钠用该法测定

由于该比色法影响因素较多

现已被HPLC法取代

Kober反应比色法

Kober反应为雌激素与

硫酸-乙醇反应呈色

在515nm附近有最大吸收

可用于雌激素类药物的比色法测定

ChP收载的复方炔诺孕酮滴丸中

炔雌醇的含量测定采用

Kober反应比色法

最后用思维导图对比色法进行小结

希望大家课后及时复习

今天的课就上到这里

谢谢大家！