5.7 紫外-可见分光光度法——计算分光光度法在线视频

大家好

今天我们学习计算分光光度法

在药物分析中的应用

首先学习维生素A含量

测定的三点校正法

维生素A为具有

共轭多烯醇侧链的环已烯

R为H即维生素A醇

R为乙酰基为维生素A醋酸酯

天然维生素A主要是全反式维生素A

效价最高

药典收载全反式维生素A醋酸酯

维生素A的含量测定

收载在药典通则0721

共收载二法

第一法紫外-可见分光光度法

第二法高效液相色谱法

维生素A 维生素A软胶囊的

测定采用第一法

维生素AD软胶囊

维生素AD滴剂的测定采用第二法

维生素A结构中具有共轭多烯醇侧链

在325~328nm范围内有最大吸收

可用于含量测定

但维生素A原料中常混有杂质

包括其多种异构体

氧化降解产物

合成中间体以及副产物等

它们都有紫外吸收

紫外吸收具有加和性

所以干扰维生素A紫外分光光度法测定

因此

在测定维生素A的含量时

为排除这些杂质的干扰

采用“三点校正法”测定含量

即在三个波长处测得吸光度后

在规定的条件下以校正公式进行校正

再计算维生素A的真实含量

我们先来看维生素A

含量测定中用到的两个概念

一 生物效价

维生素A的含量用生物效价

即每克所含国际单位（IU/g）表示

二 换算因子

换算因子定义为单位百分

吸收数值所相当的效价

即

维生素A的国际单位规定

1IU=0.344μg全反式维生素A醋酸酯

因此

每1g维生素A醋酸酯相当的国际单位数

就可以计算得到是2907000IU

维生素A醋酸酯在环己烷中的

百分吸收系数为1530

所以直接滴定法测定维生素A醋酸酯时

换算因子=2907000/1530=1900

实际上 到此以后 就可以知道

维生素A的含量测定

有一个方法叫直接测定法

测定的对象是维生素A醋酸酯

溶剂 环己烷 E_1cm^(1%) 1530

换算因子 1900

同样我们得到

1IU=0.300μg全反式维生素A醇

同理计算可以知道

皂化法 测定 维生素A醇

溶剂 异丙醇 E_1cm^(1%) 1820

换算因子 1830

本法是在三个波长处测得吸光度

根据校正公式计算吸光度A校正值后

再计算含量

其原理主要基于以下两点

杂质的无关吸收在310～340nm的

波长范围内呈线性

且随波长的增加吸光度下降

物质对光的吸收呈加和性

即供试品在各波长处的吸光度值

是维生素A与杂质吸光度的代数和

吸收曲线也是二者吸收的叠加

三点波长如何进行选择呢

选择原则为

一点选择在维生素A的

最大吸收波长处（λ₁）

其他两点在λ₁的两侧

各选一点（λ₂和λ₃）

使用直接测定法测定维生素A醋酸酯时

用的是等波长差法 也就是

使λ₃-λ₁ =λ₁ -λ₂

ChP规定

测定维生素A醋酸酯时λ₁ = 328nm

λ₂ = 316nm

λ₃ = 340nm

Δλ= 12nm

皂化法测定维生素A醇时

是用等吸收比法选择波长

规定 即

ChP规定

λ₁ = 325nm

λ₂ = 310nm

λ₃ = 334nm

直接测定法

本法适用于纯度高的维生素A

醋酸酯的含量测定

具体做法如下 第一

选择最大吸收波长

取供试品适量

加环己烷溶解制成每1ml中

含9～15单位的溶液

然后去选择最大吸收波长

看看它的吸收波长在哪里

如果最大吸收波长在

326～329nm之间

测定其吸收峰的波长

并在300、316、328

340、360nm五个波长处的吸光度

如果最大吸收波长不在

326～329nm之间

则应采用皂化法测定含量

如果最大吸收波长在

326～329nm之间

那么第二个步骤就是

计算吸光度比值及差值

要计算各波长下的吸光度与

328nm波长下的吸光度的比值

将计算得到的五个吸光度比值分别与

中国药典规定的吸光度比值相减

即得到五个差值

判断每个差值是否超过规定的±0.02

三 判断法选择A值

如果最大吸收波长

在326～329nm之间

并计算得到的五个波长下的

差值均不超过±0.02时

则直接用A₃₂₈

如果最大吸收波长

在326～329nm之间

但计算得到的波长下的差值

有一个或几个超过±0.02

这时应计算A₃₂₈（校正）

并计算f

并按下法判断

校正公式

A₃₂₈校正=3.52（2 A₃₂₈－A₃₁₆－A₃₄₀）

如果f值在±3.0%之间

则仍直接用A₃₂₈进行计算

如果f值在-15%～-3%之间

则以A₃₂₈（校正）进行计算

如果f值小于-15%或大于+3%

则供试品需按皂化法测定

闭上眼睛想一想

我们首先来看它的最大吸收波长

在不在326-329之间

如果不在就要用皂化法

如果在 就测定五个波长吸光度

再算五个吸光度比值

再解就得到五个差值

得到五个差值以后

如果每个差值都没有超过±0.02

我们就选A₃₂₈

如果超过了 计算A₃₂₈和f

如果f在±3%之间

那么就用A₃₂₈计算

如果f在-15%到-3%之间

那么就用A₃₂₈（校正）计算

如果出了范围就要用皂化法

皂化法

本法适用于维生素A醇的含量测定

所以当我们拿到样品的时候

样品+乙醇+氢氧化钾溶液

置水浴中煮沸回流

让维生素A的酯键水解

生成维生素A醇

生成维生素A醇以后

用不含过氧化物的乙醚振摇提取

把维生素A醇提取到乙醚层

分取乙醚层

微温挥去乙醚

迅速加异丙醇溶解并定量稀释

制成每1ml中含维生素A

9～15单位

这个时候也要看最大吸收波长

是不是在323-327nm之间

因为是维生素A醇

所以最大吸收波长

是不是在323-327nm之间

而且要测定

在300nm、310nm、325nm

与334nm四个波长处测定吸光度

如果吸收峰的波长

在323～327nm之间

且300nm波长处的吸光度

与325nm波长处的吸光度的

比值不超过0.73

按下式计算校正吸光度

并计算f值

校正公式

在这里大家可以自己看

如果f值在±3%之间

则直接用A₃₂₅进行计算

如果f值小于-3%或大于+3%

则以A₃₂₅（校正）进行计算

如果吸收峰的波长不在

323～327nm之间

或300nm波长处的吸光度

与325nm波长处的吸光度的

比值超过0.73

所以前两个方法都不行

那就要把样品进行处理 如何处理呢

色谱分离

把杂质分离后

再测定

就是因为杂质太多

前两个方法都没办法用

所以要色谱分离 再测定

前两个方法都学到A

学A就是为了求E

因为E等于A除以cl

所以在直接法有时候用A328

有时候用A328（校正）

如果学的是A328就用A328计算

如果学的是A328（校正）

就用A328（校正）计算

造化法中 如果学了A325（校正）

那就用A325（校正）进行计算

所以前面所做的工作 就是学了A值

然后就可以计算E

计算出E之后

我们知道换算因子等于效价除以E

那么效价等于E乘以换算因子

直接法的换算因子是1900

皂化法换算因子是1830

所以要乘以1900还是1830

看是用什么方法就可以了

那么有了效价之后

就可以求百分标示量

那么在这个方法测定时

勿强烈振摇

因为是有机溶剂溶液

强烈震摇易造成乳化

溶液浑浊后就没办法测定吸光度了

勿强烈振摇

避免乳化

测定前

应对仪器波长进行校正

在三点法中有两点

是在上坡和下坡来做的

吸收峰两侧的波长处测定

因此仪器波长若不够准确时

会有较大误差

在这个方法中

对仪器波长进行校正至关重要

维生素A很容易被氧化

所以测定要在

半暗室中快速测定

双波长分光光度法

双波长就是用了两个波长

在待测组分的最大吸收波长处

测定待测组分

和干扰组分吸光度的总和

这个波长就叫测定波长

用λ₁表示

另选一适当波长

（参比波长，λ₂）测定吸光度

测的是待测组分和干扰组分吸光度总和

但是 选波长是有要求的

并使干扰组分在测定波长

和参比波长处的吸光度相等

那么有了这个条件以后

就可以来进行推导

经推导

在两个波长处

吸光度差值（ΔA）

仅与待测组分的浓度有关

而与干扰组分无关

也就是∆A∝Ca

这个时候就可以定量了

可以用对照品比较法进行定量

或者是标准曲线法定量

这个就是双波长分光光度法

盐酸氯丙嗪为吩噻嗪类药物

结构中硫氮杂蒽母核中的硫为-2价

很容易被氧化为砜和亚砜

注射液制备中需加抗氧剂

抗氧剂和氧化产物影响

紫外-分光光度法含量测定

USP盐酸氯丙嗪注射液的

含量测定采用萃取-双波长分光光度法

萃取除去抗氧剂的干扰

双波长分光光度法排除

氧化产物 如砜、亚砜等的干扰

对照品比较法定量

测定波长为盐酸氯丙嗪的

最大吸收波长254nm

参比波长为277nm

氧化产物在254nm

与277nm波长处的吸光度相等

二阶导数分光光度法

在这里还是对吩噻嗪类药物制剂而言

吩噻嗪类药物制剂中

有抗氧剂 有氧化产物

做的时候一般要进行萃取

可以消除其干扰

但萃取时操作繁琐

待测组分因经两次提取易损失

致使测定结果精密度不高

准确度较差

如果采用二阶导数光谱法

就可以消除抗氧剂等其他组分的干扰

且可提高测定的精密度和灵敏度

BP采用二阶导数光谱法

测定奋乃静片的含量

干扰物的二阶导数光谱

近似为接近基线的一条直线

不干扰测定

因此可从二阶导数光谱

量取峰～谷振幅值

对照品比较法定量

最后用思维导图对

非水溶液滴定法进行小结

希望大家课后及时复习

今天的课就上到这里

谢谢大家！