体内生物样品分析的前处理（一）在线视频

大家好

在前期的学习中我们知道

体内样品中干扰杂质多

被测目标物浓度低

因此必须进行样品前处理

今天我们学习体内生物样品的前处理

样品前处理的目的是什么呢

我们知道药物进入生物体后

其可能呈现的形式包括游离型原形药物

与血浆蛋白结合的原形药物或称结合物

Ⅰ相代谢产物

Ⅱ相代谢产物（或称缀合物）

因此为测定药物或代谢产物的总浓度

通常需要对生物样品进行前处理

使药物或代谢物从其结合物

或缀合物中释放出来

使待测药物游离 便于分析

生物样品的基质中通常

含有大量内源性物质

如血浆或血清中既含有高分子的

蛋白质和低分子的糖 脂肪等有机物

也含有Na+、Cl-等无机化合物

尿液中既含尿素 肌酸

尿囊素 氨等有机化合物

也含Na+、K+、Cl-等

这些成分的存在经常

会干扰目标物的测定

因此需要进行分离和净化预处理

以提高分析方法的选择性

生物样品中目标分析物的浓度通常极低

一般为µg/ml或ng/ml水平

通常需要对样品中的目标物

进行富集预处理

以满足分析方法的灵敏度要求

生物样品基质中含有的蛋白质

脂肪 不溶性颗粒等杂质

可污染 劣化分析仪器

因此

需要对生物样品进行预处理

如HPLC LC-MS LC-MS/MS等仪器

为防止蛋白质在色谱柱上的沉积 堵塞

至少需要去除生物样品中的蛋白质

生物样品预处理

可防止分析仪器的污染

改善分析环境

提高测定方法的效能

选择生物样品前处理方法时

应综合考虑以下因素

生物样品分析的目的 生物样品的种类

药物的性质和体内存在形式

被测药物的浓度范围 所用分析技术等

药物测定目的不同

样品制备的要求不同

如

急性中毒病例

要求快速鉴定药物

尽快获得其浓度数据

样品制备要求可以粗放些

药代动力学研究

要求获得药物及其代谢物

在生物体内的动态变化规律

包括吸收 分布

代谢和排泄（ADME）

需有足够的数据信息

样品制备要求全面 细致

待测生物样品的种类

决定样品制备的具体方法

血样及组织匀浆样品含有大量蛋白质

常需先去除蛋白质后

进行下一步的提取分离

尿中药物大多呈缀合状态

常需采用酸或酶法使缀合物水解

游离出药物

然后再进行后续处理

而唾液含有大量黏蛋白

需离心除去

头发样品易受各种污染

需先进行清洗

再进行后续有机破坏处理

才可以除去这些污染

样品的分离制备与分析方法的

选择依赖于待测药物和代谢物的

理化性质及它们的存在形式

如药物的酸碱度（pKa 值）

决定制备时是否需要调节pH值

分子的亲脂性是选择提取溶剂的依据

药物的挥发性决定制备过程

是否存在挥发损失

可采用何种方法进行浓缩

能否采用气相色谱法测定等

药物的光谱特征和功能团

性质涉及分析仪器的选择

如是否需进行衍生化处理

还是选用特殊检测器

待测物的化学稳定性

涉及样品处理的操作条件

如是否需要避光操作

药物在体内的不同存在形式

及血浆蛋白结合率的高低决定了

样品制备方法的选择

等等

生物样品中药物的浓度相差极为悬殊

如地高辛的有效血药浓度为

0.9~2.2ng/mL

阿司匹林血药浓度）

可以达到微克每毫升

但不同的药理作用所需要的血药浓度不同

为 20~100μg/mL（镇痛）

100~300μg/mL（风湿性关节炎）

250~400μg/mL（风湿热）

药物在体内浓度差别这么大

显然浓度高的样品处理要求稍低

浓度越低则样品制备的要求越高

分析方法的选择性 检测系统的灵敏度

及对不纯样品所带来污染的耐受程度等

决定了样品制备的不同要求

例如

免疫分析法具有很高的特异性

在各种免疫测定中通常

不必考虑药物的分离

只需采取简单的除去蛋白质

或适当浓集即可对样品进行检测

色谱法具有分离分析功能

且有较高的灵敏度

与不具分离功能的光谱法相比

纯化要求比后者低

常用预处理方法包括

去除蛋白质 缀合物水解 有机破坏

分离与浓集 化学衍生化法等

在测定血样及组织匀浆等

样品中的药物时

首先要去除蛋白质

去除蛋白质的目的是

一 使结合型药物释放出来

便于测定药物的总浓度

二 为得到较“干净”的提取液

减少乳化的发生

使提取分离能够顺利地进行

三 防止仪器污染

消除对测定的干扰

去除蛋白质的方法根据原理的不同

可分为蛋白沉淀法

超滤法和酶解法3类方法

蛋白沉淀法可以释放与蛋白结合的药物

测定药物的总浓度

超滤法采用半透膜分离游离型

和结合型药物

可以测定游离药物的浓度

酶解法可以把蛋白质水解成

可溶性小分子多肽

同时释放与蛋白结合的药物

测定药物的总浓度

特别适合蛋白结合率高的药物

根据沉淀原理不同可采用加入

与水相混溶有机溶剂、 加入中性盐

与强酸或重金属盐成盐

或加热等方法来沉淀蛋白质

四种方法中沉淀效率

最高的是与强酸沉淀法

但该法对酸性条件下

不稳定的药物不适用

且残留强酸对后期的分析可能有干扰

如不宜采用LC-MS/MS分析

加入与水相混溶有机溶剂方法简单

采用乙腈沉淀效率尚可

适用于极性较大的药物

但溶剂用量较大

降低了药物浓度

对低浓度样品的分析不利

中性盐盐析上清液的

pH值为7.0~7.7

适用于在酸性和碱性条件下

不稳定的药物

但其沉淀效率不高

且残留中性盐对后续分析有干扰

热凝固法操作简单

沉淀效率尚可

但其只适用于对热稳定的药物

强酸下易水解或对热不稳定的药物

不适合采用蛋白沉淀法时

可选用酶解法

应用蛋白水解酶

可在温和的条件下有效地水解生物蛋白

将与蛋白结合的药物释放出来

酶解需要在一定 pH 一定温度

一定反应时间下完成

最常用的酶是枯草菌溶素

它是一种细菌性碱性蛋白分解酶

在pH 7.0~11.0 范围内

使蛋白质肽键降解

在 50~60℃具有最大活力

这种温和的方法对于

对酸对热不稳定的药物是适用的

超滤法为游离药物测定的首选方法

是利用半透膜只允许小分子通过

而不允许大分子通过的原理

使游离型与结合型药物分离

药物或其代谢物与体内的

内源性物质结合生成的产物称为缀合物

尿中药物多数呈缀合状态

为了测定尿液中药物的总量

在直接测定或萃取分离之前

均需要进行水解

将缀合物中的药物释放出来

水解方法主要有

酸水解 酶水解和溶剂解

酸水解 常用盐酸

简便 快速

但专一性较差

不适于对酸不稳定的药物和代谢物

酶水解

通常使用的水解酶是

β-葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶

或两者的混合物

酶解法条件较温和

且专属性强

但费时费力

还可能引入黏液蛋白造成干扰

溶剂解也是一种较温和方法

但一般只用于硫酸酯缀合物

目前对于缀合物的分析

逐渐趋向于直接测定缀合物的含量

以获得药物在体内

以缀合物形式存在的量

获得缀合物占所有排出药物总量的比率

从而为了解药物代谢情况

提供更多的信息

最后用思维导图对本节内容进行小结

希望大家课后及时复习

今天的课就上到这里

下节课见

谢谢大家！