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分光光度计的设计原理和使用规范


分光光度法是一种通过测定有色化合物吸收了多少光来进行分子精确定量分析的方法。广泛的用于生命科学领域大量化合物的定量研究。分光光度法定量需要使用到分光光度计,我们今天就以722N型可见光分光光度计为例,来学习分光光度计的原理和使用,下面我们先来了解一下分光光度计的原理吧

早在1729年的时候,法国科学家皮埃尔布格Pierre Bouguer就发现了光在介质中的衰减现象,1760年,另一位法国科学家郎伯Johann Heinrich Lambert在其著作中描述了光在吸收介质中呈指数衰减的现象,也就是吸光度与液层厚度成正比,1852年德国科学家August Beer发现物质的吸光度与物质浓度成正比,这些研究结果合在一起就是我们熟悉的郎伯比尔定律。

郎伯-比尔定律就是在一定条件下,一束单色光通过吸收介质的溶液后,引起该单色光强度降低,吸收介质吸收部分光能,吸收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低的程度成正比,用公式表示即为A=ECL,其中A为吸光度,E为常数,C为浓度,L为光程。也就是说物质的光吸收与物质的浓度和液层厚度成正比。

当溶液的浓度C若用mol/L表示,光程L用cm来表示时,则E用另一符号ε来表示,称为摩尔消光系数(Molar Extinction Coefficient),指的是当物质的浓度为1mol/L时的吸光系数

所以根据朗伯比尔定律,如果我们想测定一个物质的浓度,就需要先知道一系列已知浓度样品的吸光度,以浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,计算曲线的斜率,然后测定未知样品的吸光度,为了减少误差,我们一般会测定3个以上的平行样,样品测定后先取吸光度值的平均值,再用吸光度的平均值除以标准曲线的斜率即可计算出样品的浓度。

而吸光度的测定就要用到分光光度计,1940年的时候,美国发明家贝克曼先生Arnold O. Beckman发明了分光光度计,不管是1940年的分光光度计还是我们今天要学习和使用的722N型分光光度计,其最基本的构造和功能是基本一致的。

分光光度计的基本构造都包括以下几部分,首先是光源,可见光一般用钨灯,钨灯会发射连续波长范围在320-2500nm之间的光,可用于可见光吸收的检测;紫外区的检测一般用氘灯,氘灯可以发射波长180-500nm的光。我们可以通过调节波长旋钮来控制只让一定波长的单色光通过比色杯后被检测器检测到,而分光光度计的功能就是通过检测器测定出液体样品的吸光度值,那么问题来了,分光光度计里面是有一个测定吸光度值的检测器吗?

事实是,并没有。吸光度值是仪器计算出来的,吸光度等于透光率倒数的对数,那么透光率是仪器测出来的吗?并不是,透光率是个百分数,也是仪器计算出来的,计算方法是透射光强度比入射光强度的百分数,这很好理解,就是除去被吸收的光以外,有百分之多少的光最终透过了样品,这是一个比率,而计算这个比率的光强,才是仪器里的光电检测器实打实测出来的。

所以,我们实际测定的时候,需要通过调节仪器,扣除掉非光源来源的光和待测物之外的光损失,也就是,我们要框定所测定透光率的两端,即0%和100%,当透射光强为0的时候,透光率等于0%,当透射光强与入射光强相同的时候,透光率等于100%

我们先来看看如何设置透射光强度为0,不同的分光光度计有不同的设计思路,对于722N型分光光度计来说,当我们把样品池盖子掀起来,侧面的挡板会自动放下来,挡住光电检测器,如此,检测器则接收不到任何光源来的光,所以就是光强度为0,透光率即为0,我们通过按动0%按钮来调节仪器透光率为0%,光通过比色杯的时候,除了被待测物吸收之外,还会被比色杯反射和折射,而且还有可能被溶剂或其他反应物吸收掉一部分,所以,我们需要把这部分与待测物无关的光吸收扣除掉,具体做法是设置“空白管”,使用相同种类的比色杯,一般加入除了待测物之外的全部试剂,以便把这些影响都扣除掉,将空白管和其他待测物放入分光光度计,将空白管置于光路上,请注意操作比色杯时需要手持磨砂面,而放入样品池时必须将透光面置于光路上,放入前请先检查比色杯壁清洁无液体和污渍残留。关闭样品池盖,按动100%按钮来调节仪器T=100%,然后按动档位更换按钮让显示屏显示吸光度值,当空白管在光路且透光率为100%的时候,吸光度应该是0,这个很好理解,既然光100%都透过去了,那被吸收的就是0了呀!

拉动样品池拉杆,依次测定各样品管的光吸收值,测定结束后请先将档位更换到透光率档再打开样品池盖,取出空白管以外的比色杯,请注意,如果需要继续测定请将空白管保留在样品池中,便于每次检查透光率100%,减少误差。

最理想的情况是所有样品均使用材质均一、干净而且干燥的比色杯,但是当我们测定样品很多的时候,就需要重复使用比色杯,这时候需要将比色杯先用去离子水洗净,洗净的比色杯壁上中会有液体残留,如果这时候直接加入下一个待测液,样品就会被稀释影响测定准确性,所以我们需要对比色杯进行润洗,去除掉残余液体的影响,具体做法是:先用吸水纸尽量吸去残余液体,然后在比色杯中加入少量待测液,倾斜比色杯,使少量待测液依次流过比色杯各个面,冲洗杯壁残余的水后倒掉,如此操作2至3次,将残余液体的影响降到最小,然后加入待测液进行测定。

在按照浓度从低到高的顺序依次测定标准曲线各管的过程中,测定过低浓度液体后,如果需要测定高浓度液体,也可以直接进行多次润洗,而无需先彻底清洗。但是测定过高浓度液体后如果需要测定低浓度或未知浓度液体,则必须先用去离子水彻底清洗比色杯并用待测液润洗后再加入待测液进行测定。

现在我们再来一起复习一遍分光光度计使用的基本流程:首先,需要提前半小时开机预热,使光源达到稳定发光的状态;其次,旋转波长旋钮设置检测波长;第三步,打开样品池盖,挡板挡住光源,调透光率为0%;第四步,将空白管和样品依次放入样品池,透光面对着光路,将空白管置于光路;第五步,关闭样品池盖,按100%按钮调透光率为100%;第六步,调至吸光度档位,显示样品吸光度值,请检查空白管的吸光度为0,如果不为0请按动0A按钮调节;第七步,拉动样品池杆,依次测定和记录样品吸光度值;第八步;测定结束后,调回透光率档,打开样品池盖,取出样品,连续测定时请将空白管一直保留在样品池中便于校对透光率;第九步,如需重复使用比色杯进行测定,请在清洗比色杯后用待测液润洗2-3次,再进行测定;第十步,测定结束后取出所有比色杯并清洗,关闭仪器。

好了,我们今天学习了722N可见光分光光度计的原理和使用,经过本次学习相信你已经清楚了了解了分光光度计的原理、基本构造和使用注意事项,但是,不同厂家的分光光度计设计不溶,操作流程也不同,我们会在后面继续学习分光光度计的设计和操作差异以及操作要点,这样你在使用其他型号分光光度计的时候,回忆一下我们刚刚学习的流程,找到相关的操作按钮,就可以顺利完成测定啦!

 


下一节:不同分光光度计的设计和操作差异

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

分光光度计的设计原理和使用规范笔记与讨论

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