当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算
在学过了紫外法测定
蛋白质浓度的实验原理和操作以后
我们一起来试试如何计算
待测液中的蛋白质浓度
我们首先来学习
最常使用的标准曲线法
计算待测液蛋白质浓度
这个表格是一位同学做出的实验数据
他设计制作的标准曲线
并且测定了一份纯蛋白样品的吸光度A值
这就是他获得的全部实验数据
我们可以用三种方法来制作标准曲线
第1种是坐标纸描图法
具体的操作是取一张坐标纸
在下面画上一条横线
这是横坐标
左侧画一条竖线
这是纵坐标
根据所设计标准
蛋白质的浓度分布在横坐标的轴上
标记出各浓度点
并注明蛋白质浓度和浓度的单位
紫外法的浓度单位是毫克每毫升
然后再纵坐标轴
根据数据所测定的吸光度范围
标记出个吸光度的点
并注明A280
在图上注明紫外法测定蛋白质
浓度标准曲线图的名称
这样标记后整个标准曲线图
就变得一目了然
方便自己和其他人查看
根据标准曲线各浓度和
吸光度的对应关系
在坐标纸上标记出每一个标准曲线点
然后用一条经过原点的直线
将所有的点连接在一起
注意因为操作误差有的点
可能不完全符合线性
画线的时候
应该让各点在线上线下均匀分布
这条就是本次紫外法测定
蛋白质浓度的标准曲线
计算三个平行样品吸光度的平均值
结果是0.359
在纵轴找到这个点
此点开始画一条横线
与标准曲线交叉处再画一条竖线
竖线与横轴的交叉点读数
即为待测样品的浓度
本次测定的结果约为0.5
第2种方法是利用Excel
等软件绘制散点图
图上同样要注明横坐标蛋白质浓度
和单位以及纵坐标A280
还有图的名称 紫外法
测定蛋白质浓度标准曲线图
便于自己和其他人查看
然后通过添加趋势线的操作
将这些点连接
并显示公式和R方
这样我们就获得了一个方程式
同样取待测样吸光度的
平均值0.359
代入方程计算出浓度
X=0.359-0.008
除以0.6999就等于0.502
所以待测样品的浓度计算结果
就是0.502毫克每毫升
R方可以告诉我们标准曲线的线性程度
R方越接近1
说明标准曲线的线性就越强
如果R方降低需要检查实验设计
的浓度范围是否在线性范围内
以及你的实验操作是否正确
除了用坐标纸描点和软件绘图以外
还可以直接用计算器或者软件
对标准曲线的数据进行计算
得到拟合方程和R方
然后将待测样的平均值
代入方程直接计算出浓度
可是我们的计算还没有结束
同学们还记得我们在配制
待测样的时候加样体积吗
我们是用一毫升原始的待测
液加三毫升的水配制成的
所以相当于对原始待测液稀释
4倍之后再进行的测定
因此我们之前计算出的
待测液浓度还要乘以4
这样最后计算出待测蛋白质
溶液的浓度就是
2.008
我们在测定时将样品稀释
是为了使其吸光度值落在
标准曲线的中段
减少相对误差
计算的时候一定要记得乘以稀释倍数
得出原始溶液的浓度
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