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SDS-PAGE电泳的原理资料文件与下载

SDS-PAGE电泳的原理

同学们好，生物体内存在着大大小小、功能不同的蛋白质，比如我们熟悉的血红蛋白、胰岛素等等。如果想要了解蛋白质的结构与功能，首先需要对它们进行分离。今天我们要学习的SDS-PAGE就是可以分离蛋白质的一种技术，除了可以分离蛋白质外，还可以对蛋白质进行定量以及测定蛋白质分子量大小。上节课我们了解了聚丙烯酰胺凝胶的组成和特性，那SDS-PAGE又是什么呢？它是怎样达到分离蛋白质的目的的呢？今天，我们就来学习SDS-PAGE电泳的原理。

 

SDS-PAGE又称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶，即PAGE，作为支持介质的一种电泳方法。SDS-PAGE是实验室常用的一项技术，可以进行蛋白质的分离纯化、定量及分子量测定等。在SDS-PAGE的基础上，还可以进行免疫印迹、双向电泳等实验。

 

通过SDS-PAGE分离和测定蛋白质分子量时，样品缓冲液中含有SDS和断裂二硫键的还原剂，如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）。它们都有什么作用呢？SDS的中文名称是十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子去污剂，带有大量的负电荷，当SDS与蛋白质结合时，所带的负电荷消除了不同种类蛋白质原有电荷的差异。SDS按照一定比例与蛋白质结合，破坏维持蛋白质空间构象的次级键，改变了蛋白质的构象，使蛋白质的形状呈现长的椭圆棒状。不同SDS-蛋白质复合体的短轴长度都是一样的，大约为1.8 nm，而长轴长度与蛋白质的分子量成正比例关系。

 

样品缓冲液中的还原剂通常是β-巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT)，它们能使蛋白质半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，使蛋白质解聚为亚基或单肽链，有助于SDS与蛋白质的充分结合。

 

经过SDS和还原剂处理后，蛋白质的迁移率不受原有电荷和形状的影响，只与蛋白质的分子大小有关，这就是SDS-PAGE能用来测定蛋白质分子质量的原因了。需要注意的是，对于寡聚蛋白质来说，SDS-PAGE测定的不是蛋白质的完整分子量，而是亚基的分子量。

 

聚丙烯酰胺凝胶电泳根据是否有浓缩效应，分为连续系统和不连续系统。连续系统使用相同孔径的凝胶和缓冲系统，不连续系统中存在不同孔径的凝胶和不同的缓冲系统。不连续系统分辨率高，它具有三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。因为电荷效应和分子筛效应在其他电泳系统中也存在，因此，在这里我们主要介绍浓缩效应。

 

浓缩效应是因为不连续凝胶系统中具有凝胶孔径的不连续、缓冲液离子成分及pH的不连续性。首先来看凝胶孔径的不连续性，凝胶的下层是浓度高、孔径小的分离胶，上层是浓度低、孔径大的浓缩胶。电泳系统中还存在缓冲液离子成分和pH的不连续性，整个电泳体系中有浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液和电极缓冲液，浓缩胶和分离胶的缓冲液都含有Tris-HCl，但pH值是不同的，浓缩胶的缓冲液pH值是6.7，分离胶缓冲液pH值是8.9，它们和pH8.3的Tris-Gly电极缓冲液共同组成了一个凝胶的不连续系统。浓缩胶的孔径大，在浓缩胶中以浓缩效应为主，主要是将蛋白质样品压缩成很窄的条带，然后在孔径较小的分离胶里通过分子筛效应将蛋白质按照分子量大小进行分离。通过刚才的介绍，我们已经了解到浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液和电极缓冲液的pH值和成分是不同的，这种不同的pH值和成分在蛋白质的浓缩和分离中起到了怎样的作用呢？

 

电极缓冲液、浓缩胶缓冲液和分离胶缓冲液中都含有Tris及HCl，Tris是缓冲配对离子。HCl在整个系统中都能解离出Cl-，图中用蓝色小球表示Cl-，它在电场中迁移最快，称为快离子或先导离子。电泳开始时，蛋白质样品在加样孔里，此时的缓冲液是pH值8.3的电极缓冲液。Cl-在电场中快速向正极移动，电极缓冲液中甘氨酸的等电点为6.0，在电场中解离为甘氨酸阴离子，向正极移动，图中用绿色方块表示。蛋白质带负电荷，向正极移动，图中用不同颜色的椭圆棒状表示。当Cl-、甘氨酸及蛋白质迁移进入pH值6.7的浓缩胶后。Cl-继续快速向前移动，此时缓冲液的pH值接近甘氨酸的等电点，因此甘氨酸解离度很小，在电场中迁移最慢，成为慢离子或尾随离子。蛋白质的迁移率介于快慢离子之间。在电场作用下，Cl-快速向前泳动，会在后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区，而电导率与电位梯度呈反比（E=I/η，E为电位梯度，I为电流强度，为电导率），因此低电导区具有了高电位梯度。这种高电位梯度推动着蛋白质和慢离子快速移动，蛋白质就被压缩成了一条线，所有蛋白质站在同一起跑线上。当进入分离胶之后，缓冲液的pH是8.9，甘氨酸的解离度增大，泳动速度变快，因为它的分子量要远小于蛋白质，所以它会超越蛋白质，浓缩效应消失，蛋白质就根据分子量大小在凝胶中进行分离。

最后要注意的一点是，浓缩胶的浓度很低，这是为了减少凝胶对蛋白质的分子筛效应，在浓缩胶中以浓缩效应为主。分离胶浓度加大，通过分子筛效应实现对蛋白质的分离。

 

有了浓缩效应，再加上电荷效应和分子筛效应，SDS-PAGE的不连续系统在分离效果和分辨率方面就有了很大的提升。

 

 


下一节:SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

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--《生物化学实验》学什么？

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

--不同需求的同学如何学习本课程？

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

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--正向移液和反向移液

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--移液器的日常校准

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--移液器的操作中易错点

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--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

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--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

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-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

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--分光光度计的操作要点

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-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

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--分光光度法测定物质浓度的实验设计

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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

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-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

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-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

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--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

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--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

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--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

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--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

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--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

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-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

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--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

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--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导（Folin酚法）

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-第三节 酶米氏常数的测定

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--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

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--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

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-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子，如何纯化呢？

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

SDS-PAGE电泳的原理笔记与讨论

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