当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 > 聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性
同学们,本周我们开始SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的学习,即SDS-PAGE的学习。在学习SDS-PAGE原理之前,我们先来了解聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理和凝胶的相关特性。
在琼脂糖凝胶电泳的学习中,我们已经认识了琼脂糖这种电泳的支持介质。今天我们要学习的聚丙烯酰胺凝胶也是实验室常用的一种电泳的支持介质。什么是聚丙烯酰胺凝胶呢?它的组成成分是什么?这些成分在凝胶聚合的过程中又起到了什么作用呢?聚丙烯酰胺凝胶具有怎样的特性使它成为了SDS-PAGE电泳好的支持介质呢?
聚丙烯酰胺凝胶是一种电泳常用的支持介质,在此基础上进行的电泳叫做聚丙烯酰胺凝胶电泳,也被称为PAGE。
PAGE广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定量等实验。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在引发剂过硫酸铵(APS)和催化剂N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合形成的。
需要注意的是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是具有中枢神经系统毒性的试剂,因此同学们呢在操作时要注意防护,避免直接接触皮肤和吸入粉尘。
凝胶聚合有光聚合作用和化学聚合两种方式。因为化学聚合作用在实验室更常用,因此这里我们主要介绍化学聚合。反应开始时,TEMED催化过硫酸铵形成硫酸自由基,然后,硫酸自由基的氧原子激活单体丙烯酰胺,活化的丙烯酰胺连接形成多聚长链结构,最后由交联剂甲叉双丙烯酰胺将丙烯酰胺长链连接成网状结构。
聚合形成的聚丙烯酰胺凝胶具有透明、有弹性、机械性能好的优点,此外它的化学性质稳定,不会和分离物发生化学反应,也没有吸附和电渗作用,因此分离效果好。通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度可以调节凝胶的孔径,从而实现分离分子量大小不同蛋白质的目的。聚丙烯酰胺凝胶具有的这些特性和优点,使它成为实验室广泛使用的电泳支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶的特性,包括机械性能、弹性、透明度以及孔径大小,这些性能取决于两个重要的指标,一个是凝胶的总浓度,用T表示,另一个是凝胶的交联度,用C表示。凝胶的浓度T是100 mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂的克数,凝胶总浓度主要影响凝胶筛孔的大小。凝胶平均孔径随着凝胶总浓度的增大而减小。交联度表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。交联度决定凝胶筛孔的最大直径。交联度过高,凝胶不透明,缺乏弹性。交联度过低,胶就呈现为糊状,不能聚合形成凝胶。
由于凝胶浓度不同,平均孔径不同,因此能通过的蛋白质的分子大小也不同。如果凝胶浓度太低,孔径太大,样品中分子量大小不同的蛋白质都随着缓冲液向前快速移动,不能得到很好的分离。如果凝胶浓度太高,孔径太小,电泳时容易拖尾,甚至蛋白质分子不能进入凝胶。因此,在实验过程中要注意选择合适的凝胶浓度。在这张表中列出了分离胶浓度与可分离的蛋白质相对分子质量之间的关系,我们在实验过程中要根据实验需要选择合适的浓度,达到分离蛋白质的目的。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
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-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
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--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试