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IMAC亲和层析

向大家介绍亲和层析的另外一种技术固定化金属离子亲和层析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography,取每个单词的字头,简称为IMAC。

这项技术和我之前谈到的亲和层析技术有什么不同呢?现在就让我和你一起进行IMAC技术的学习吧。

IMAC技术是依据待分离物质与金属离子之间的结合特性。

,假如蓝色的图形表示的是金属离子,灰色的不规则图形表示的是蛋白质,要特别注意,这种蛋白质表面需要有一定量的组氨酸,组氨酸侧链的咪唑基,如图红色标注的部分所示,能够和金属离子紧密结合形成络合物,这就是IMAC技术所利用的物质之间的特异结合性质。换句话说就是,蛋白质因为有组氨酸才可以和金属离子特异结合。

那如何利用这种特异结合进行物质分离纯化呢?IMAC层析柱,用该柱进行蛋白质分离纯化的关键自然是层析柱中的吸附介质/层析柱介质。配基亚氨基二乙酰乙酸钠能够作为桥梁连接载体并鳌合二价金属离子,三者最终形成了IMAC亲和层析柱的吸附介质。

准备好了IMAC亲和柱的吸附介质,那么现在我们就可以分离想要的目标物质啦。,假如样品混合物中有三种蛋白质A、B和C。我要的目标蛋白是C,这里显示杂蛋白A和B由于不能与亲合柱吸附介质结合而穿柱流出,只有C蛋白能够与吸附介质上的金属离子结合形成络合物结合在柱上,如此,目标蛋白就和杂蛋白分开啦。这就是所谓的固定化金属离子亲和层析,IMAC技术。

前面提到,蛋白质和金属离子结合依据的是蛋白质表面的组氨酸残基侧链咪唑基。其实蛋白质表面的其他氨基酸残基,例如色氨酸、半胱氨酸侧链基团也可以与过渡金属离子Cu2+、 Zn2+、 Ni2+和 Fe3+形成复合物,只是它们的结合能力远远小于组氨酸残基与金属离子的结合。IMAC技术既然依据的是蛋白质与金属离子的结合的特性,那么结合能力的强弱就自然成为影响蛋白质分离效果的关键因素。所以,为了提高纯化效率,在实际操作中,常常是为待纯化的目标蛋白加上多个组氨酸,以增强蛋白质与金属离子的结合。

习惯上,研究人员会加6个以上连续的组氨酸到目标蛋白质的N端或者C端,形成融合蛋白,由这些组氨酸残基的咪唑基与柱凝胶介质上鳌合的金属离子紧密结合,以达到分离纯化蛋白的目的。

当纯化带有多聚组氨酸标签的融合蛋白质时,首先选择的是Ni2+离子。

你可能有疑惑了,难道没有组氨酸标签的蛋白就无法用该项技术分离纯化了吗?也不完全是,有些蛋白质虽然没有标签,但是也可以和金属离子特异结合,这种情况当然可以用IMAC技术了,只是选择的金属离子依据其与目标蛋白的结合特性不同而有所差异。有的蛋白质特异结合Cu2+,那具体操作时就选择Cu2+。当分离纯化的蛋白质是未知蛋白时,首先选择Cu2+,因为Cu2+能够结合很多种蛋白质。

其实,实验室目前常用的IMAC技术,普遍是用于分离纯化带有多聚组氨酸标签的蛋白质。

那如何利用IMAC技术分离纯化带有多聚组氨酸标签的融合蛋白呢?在你脑海中,可能会了一个问号,什么是带有多聚组氨酸标签的融合蛋白呢,如何获得它呢?解决这个问题还需要分子生物学的知识。

在这里我简化说明一下,假如你可以获得一段编码多聚组氨酸和编码目标蛋白的DNA序列,你把这段序列插入到一个细菌质粒中。质粒就是细菌基因组DNA之外的环形DNA分子,它可以随着细菌的生长进行复制,转录和翻译,如此插在质粒上的编码融合蛋白的序列就被转录和翻译出来,在细菌细胞中就有了你想要的带有多聚组氨酸标签的融合蛋白啦。

请看这张图,图中最左边的上面圆圈是携带有融合蛋白DNA序列的质粒。当你将质粒转入大肠杆菌中,融合蛋白就能够在细菌细胞中被翻译出来,裂解大肠杆菌细胞,裂解液中就含有丰富的多聚组氨酸标记的融合蛋白。将裂解液加到Ni柱上,用清洗缓冲液清洗未与亲和柱结合的其他蛋白,之后再用含有较高浓度咪唑的洗脱液,洗脱目标蛋白。如此你就获得到了想要的目标蛋白啦。


下一节:IMAC亲和层析技术的基本步骤

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

IMAC亲和层析笔记与讨论

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