当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 紫外法测定蛋白质浓度的操作方法
我们在上一节中学过了紫外法
测定蛋白质浓度的实验原理
接下来我们一起来看看利用
标准曲线法测蛋白紫外吸收
进而计算蛋白质溶液浓度的实验设计
操作和注意事项
首先当你要建立一个标准曲线法
测定物质浓度的实验的时候
第一要考虑的是这个方法的测定浓度范围
只有在此范围内测定吸光度
和浓度才成线性关系
紫外法的测定浓度范围一般是
0.1~1毫克每毫升之间
所以我们的标准曲线就定在这个范围内
让不同浓度的蛋白质标准液
平均分布在这个范围中
除了考虑测定浓度的范围以外
我们还需要考虑实验体系的大小
使用不同仪器设备和比色杯
需要的最低测定体积不同
设计实验体系前要确定用什么
比色杯需要多少液体才够测定
还要留出润洗比色杯的液体体积
我们学生实验中常用的都是
一厘米光径的比色杯
常用的分光光度计
光路高度一般在比色杯高度的一半的位置
要保证液体盖过光路
至少需要三毫升液体
所以常用的实验设计体系
一般是4~5毫升
在这个范围内让6~10个标准
蛋白管尽量做到浓度均匀分配
这两条是我们在设计标准
曲线时主要考虑的因素
现在你都知道了
建议你把视频暂停
自己尝试设计一下标准曲线
各管的浓度和加样量
然后再跟我们接下来要公布的对照一下
看看自己设计的是否合理
这里我们给大家提供两套操作体系方案
都符合实验设计原则
和你设计的一样吗
大家可以发现
我们用来配制标准曲线的标准蛋白溶液的
浓度与标准曲线中最高浓度的管是一致的
这样操作的好处是每一管的
加样量不会太少
尽量减少同学们由于对移液器操作不熟练
导致加液量差异带来的误差
如果你已经操作很熟练
可以根据自己的需要和习惯采用
更高浓度的标准蛋白溶液
你现在就可以试试用1%的标准蛋白溶液
如何配置紫外法的标准曲线管呢
欢迎在论坛进行讨论
确定了标准曲线
各管的浓度和加样的体积
接下来要确定的是样品的加入量
前面我们学习比色分析法的时候已经知道
样品的浓度一定要在标准曲线中间
的1/3才可以尽量减低误差
所以在测定前应该通过查阅资料或者
预实验来确定待测溶液的浓度范围
将溶液稀释到浓度在标准曲线
中间1/3的范围内
然后和标准曲线一起测定
测定后再根据稀释倍数计算
待测溶液的蛋白质浓度
比如我们实验选用了8个点的标准曲线
预实验结果应该将待测液稀释5倍
为了减少误差
我们做三个待测液的平行样
所以最终的加样计划就是这样的
确定了加样体积
我们就可以开始做实验了
还记得在分光光度计使用一节
我们学过仪器必须先预热
20~30分钟吗
建议你估计好自己的操作时间
在开始测定前的20~30分钟
打开仪器和氘灯预热
将试管做好标记
依次加入设计体积的水
我们在配置标准曲线的时候
一般先加入水
这样不会对后续操作造成污染
若先加入蛋白质溶液
后期加水的时候就要很小心
避免污染移液器和吸头
加入相同的液体
不用更换吸头
因为蛋白质也是水溶液
水不会对其造成污染
所以加完水再加蛋白质的时候
也可以不用更换吸头
如果考虑吸头内部可能吸附水分
则更换新的吸头
并预润湿2~3次之后
吸取蛋白质溶液
依次加入到各试管中
吸取待测蛋白溶液前务必更换新的吸头
因为这是和标准蛋白质溶液不同的溶液
加样结束
待分光光度计预热够时间并确认
波长已经设定在280纳米
就开始进行测定
使用的石英比色杯干净
而且干燥的时候不用润洗
直接倒适量液体进比色杯即可
首先将标准曲线管1加入到相当于
比色杯2/3~3/4高度的液体
放入分光光度计
这是标准曲线的空白管
在整个测定过程中都不再取出
用于每次校正仪器的透光率100%
然后依次将管二
管三倒入适量液体放入分光光度计
本仪器采用的是挡光块
帮助调节透光率为0%
盖上比色池盖
拉动样品池拉杆
将空白管至于光路上
按100%调透光率为100%
然后将档位调节到吸光度的A档
这时候数值应该显示为0
拉动拉杆
让标准曲线的第二
三四管依次至于光路上
读取并记录吸光度的值
本轮测定结束
将档位调回到透光率T档
打开样品池盖
将空白管保持不动
取出剩余的三支比色杯
倒掉溶液
按照我们之前讲过的润洗方法
分别用标准曲线的四五六管进行润洗
然后再加入适量的液体
检查比色杯外壁洁净
放入样品池
盖上样品池盖
检查透光率100%没有问题
调到吸光度A档
拉动样品池杆
将标准曲线四五六管依次
至于光路记录数据
然后调回透光率档
取出标准曲线四五六管的比色杯
样品管的浓度应该不会高于
标准曲线的四五管
所以我们在测定样品管之前需要
用水将比色杯彻底清洗
尽量去除杯内残余水分
然后用样品液按润洗的步骤
将比色杯润洗2~3遍之后
再将样品液加入比色杯
按照仪器操作步骤进行测定和记录
测定完成后
按操作规范取出比色杯
用水彻底清洗
实验全部结束后
关闭分光光度计
取出所有比色杯
反复冲洗干净
倒扣在滤纸上晾干
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