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紫外法测定蛋白质浓度的操作方法在线视频

下一节:紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

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紫外法测定蛋白质浓度的操作方法课程教案、知识点、字幕

我们在上一节中学过了紫外法

测定蛋白质浓度的实验原理

接下来我们一起来看看利用

标准曲线法测蛋白紫外吸收

进而计算蛋白质溶液浓度的实验设计

操作和注意事项

首先当你要建立一个标准曲线法

测定物质浓度的实验的时候

第一要考虑的是这个方法的测定浓度范围

只有在此范围内测定吸光度

和浓度才成线性关系

紫外法的测定浓度范围一般是

0.1~1毫克每毫升之间

所以我们的标准曲线就定在这个范围内

让不同浓度的蛋白质标准液

平均分布在这个范围中

除了考虑测定浓度的范围以外

我们还需要考虑实验体系的大小

使用不同仪器设备和比色杯

需要的最低测定体积不同

设计实验体系前要确定用什么

比色杯需要多少液体才够测定

还要留出润洗比色杯的液体体积

我们学生实验中常用的都是

一厘米光径的比色杯

常用的分光光度计

光路高度一般在比色杯高度的一半的位置

要保证液体盖过光路

至少需要三毫升液体

所以常用的实验设计体系

一般是4~5毫升

在这个范围内让6~10个标准

蛋白管尽量做到浓度均匀分配

这两条是我们在设计标准

曲线时主要考虑的因素

现在你都知道了

建议你把视频暂停

自己尝试设计一下标准曲线

各管的浓度和加样量

然后再跟我们接下来要公布的对照一下

看看自己设计的是否合理

这里我们给大家提供两套操作体系方案

都符合实验设计原则

和你设计的一样吗

大家可以发现

我们用来配制标准曲线的标准蛋白溶液的

浓度与标准曲线中最高浓度的管是一致的

这样操作的好处是每一管的

加样量不会太少

尽量减少同学们由于对移液器操作不熟练

导致加液量差异带来的误差

如果你已经操作很熟练

可以根据自己的需要和习惯采用

更高浓度的标准蛋白溶液

你现在就可以试试用1%的标准蛋白溶液

如何配置紫外法的标准曲线管呢

欢迎在论坛进行讨论

确定了标准曲线

各管的浓度和加样的体积

接下来要确定的是样品的加入量

前面我们学习比色分析法的时候已经知道

样品的浓度一定要在标准曲线中间

的1/3才可以尽量减低误差

所以在测定前应该通过查阅资料或者

预实验来确定待测溶液的浓度范围

将溶液稀释到浓度在标准曲线

中间1/3的范围内

然后和标准曲线一起测定

测定后再根据稀释倍数计算

待测溶液的蛋白质浓度

比如我们实验选用了8个点的标准曲线

预实验结果应该将待测液稀释5倍

为了减少误差

我们做三个待测液的平行样

所以最终的加样计划就是这样的

确定了加样体积

我们就可以开始做实验了

还记得在分光光度计使用一节

我们学过仪器必须先预热

20~30分钟吗

建议你估计好自己的操作时间

在开始测定前的20~30分钟

打开仪器和氘灯预热

将试管做好标记

依次加入设计体积的水

我们在配置标准曲线的时候

一般先加入水

这样不会对后续操作造成污染

若先加入蛋白质溶液

后期加水的时候就要很小心

避免污染移液器和吸头

加入相同的液体

不用更换吸头

因为蛋白质也是水溶液

水不会对其造成污染

所以加完水再加蛋白质的时候

也可以不用更换吸头

如果考虑吸头内部可能吸附水分

则更换新的吸头

并预润湿2~3次之后

吸取蛋白质溶液

依次加入到各试管中

吸取待测蛋白溶液前务必更换新的吸头

因为这是和标准蛋白质溶液不同的溶液

加样结束

待分光光度计预热够时间并确认

波长已经设定在280纳米

就开始进行测定

使用的石英比色杯干净

而且干燥的时候不用润洗

直接倒适量液体进比色杯即可

首先将标准曲线管1加入到相当于

比色杯2/3~3/4高度的液体

放入分光光度计

这是标准曲线的空白管

在整个测定过程中都不再取出

用于每次校正仪器的透光率100%

然后依次将管二

管三倒入适量液体放入分光光度计

本仪器采用的是挡光块

帮助调节透光率为0%

盖上比色池盖

拉动样品池拉杆

将空白管至于光路上

按100%调透光率为100%

然后将档位调节到吸光度的A档

这时候数值应该显示为0

拉动拉杆

让标准曲线的第二

三四管依次至于光路上

读取并记录吸光度的值

本轮测定结束

将档位调回到透光率T档

打开样品池盖

将空白管保持不动

取出剩余的三支比色杯

倒掉溶液

按照我们之前讲过的润洗方法

分别用标准曲线的四五六管进行润洗

然后再加入适量的液体

检查比色杯外壁洁净

放入样品池

盖上样品池盖

检查透光率100%没有问题

调到吸光度A档

拉动样品池杆

将标准曲线四五六管依次

至于光路记录数据

然后调回透光率档

取出标准曲线四五六管的比色杯

样品管的浓度应该不会高于

标准曲线的四五管

所以我们在测定样品管之前需要

用水将比色杯彻底清洗

尽量去除杯内残余水分

然后用样品液按润洗的步骤

将比色杯润洗2~3遍之后

再将样品液加入比色杯

按照仪器操作步骤进行测定和记录

测定完成后

按操作规范取出比色杯

用水彻底清洗

实验全部结束后

关闭分光光度计

取出所有比色杯

反复冲洗干净

倒扣在滤纸上晾干

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

紫外法测定蛋白质浓度的操作方法笔记与讨论

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