当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳 > 核酸琼脂糖凝胶电泳的原理
通过DNA的提取实验,同学们已经掌握了DNA提取的方法,那怎样证明我们成功提取到了DNA呢?DNA的大小是否正确呢?今天我们学习的核酸琼脂糖凝胶电泳就是实验室常用的一种能够对DNA进行分离和鉴定的方法。
本节课上,我们会了解到琼脂糖凝胶的性质,它是由什么组成的?它作为电泳的支持介质具有怎样的优点?此外,我们也会介绍核酸琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理,包括分子筛效应和电荷效应,以及DNA在电场中的迁移会受到哪些因素的影响。
我们先来回顾下什么是电泳呢?电泳是指在电场作用下,带电颗粒向与其电性相反的电极移动。带电颗粒因为分子大小、构型以及所带电荷不同,因此在电场中具有不同的涌动速度,从而得到分离。
电泳有不同的分类方法,根据分离原理,可以分为区带电泳、移动界面电泳和稳态电泳;根据载体介质的不同又可以分为醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。
琼脂糖凝胶电泳就是我们这节课学习的内容了,它是以琼脂糖为支持物进行的电泳,是实验室常用的分离、鉴定、量化和纯化核酸的实验技术。
琼脂糖是从天然红色墨角藻中提取的一种胶状多聚糖,它是由重复的异二糖,即琼脂二糖,以α-1,3糖苷键连接而成的中性物质。琼脂二糖是由D-半乳糖及其衍生物3,6-酐-α-L-半乳糖通过β-1,4糖苷键结合而成。
由于琼脂糖凝胶具有无毒、透明、电泳图谱清晰,分辨率高等特点,使它成为了生命科学和相关领域研究中重要的电泳支持介质。通过调整琼脂糖的浓度可以控制凝胶孔径,达到制备分子大小不同的核酸片段的目的。此外,因为凝胶胶凝温度和熔点低,凝胶具有了热可逆性,即加热溶解,冷却凝固的特点。
我们将琼脂糖粉末加入缓冲液,加热并冷却后,就会形成凝胶基质。它的孔径直径从50到200纳米不等,由凝胶浓度控制。 温度高于90℃时,琼脂糖就会融化,变成无规卷曲。冷却后,两个琼脂糖链形成由氢键连接的螺旋纤维。进一步冷却至胶凝固点以下,通常小于40°C,就会有更多氢键连接形成螺旋束网络,进而形成具有三维网格的凝胶。由于加热可破坏维持网格结构的氢键,因此琼脂糖形成的凝胶具有热可逆性。通过溶解含有目的片段的凝胶,可以回收样品,用于后续试验。
琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是分子筛效应和电荷效应的双重作用。DNA骨架上的磷酸基团可以解离,在高于等电点的pH溶液中带负电荷,当受到电场作用时,核酸从负极(阴极)向正极(阳极)迁移,这是电荷效应。此外,因为琼脂糖凝胶具有网状结构,不同分子大小和构象的DNA在凝胶中受到的阻力不同。小分子物质受到的阻力小,移动快。大分子物质在涌动中受到的阻力大,移动慢,这是分子筛效应。因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离既与净电荷的性质和数量有关,也与分子大小相关,这就大大提高了分辨能力。
DNA在电场中移动的速度用迁移率表示。
DNA的迁移率主要与分子大小和分子构型有关,同时也与凝胶浓度等因素相关。
首先,来看DNA分子大小与迁移率的关系,凝胶电泳中核酸的迁移距离通常与其分子大小具有可预测的相关性,从而能够计算样品中核酸的大小。 对于线性双链DNA片段来说,在一定范围内,迁移距离与分子量的对数成反比。分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中移动,因而迁移的速度越慢。
分子量相同的DNA迁移率就会完全相同吗?这可不一定。有时分子量相同的DNA迁移率也会有差别,这是因为它们的构型不同。相同分子量的线状DNA、有切口的开环DNA和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度是不同的,超螺旋DNA结构紧凑,移动最快,带切口的DNA是一个松弛、开放的构型,因而体积大,在凝胶中迁移缓慢,线性DNA的迁移速度则介于两者之间。
琼脂糖网状结构的孔径取决于它的浓度,DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。对于一个给定大小的线状DNA分子,迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。比如这张图片,是在相同电泳条件下,同一种DNA分子量标准在1%,2%和3%的琼脂糖凝胶中分离的结果。红色圆点标出的是 1 kb的DNA片段,可以看出它在不同凝胶中的迁移率是不同的。因此要有效分离大小不同的DNA片段,需要选用适当浓度的琼脂糖凝胶。表中是分离不同长度的DNA片段推荐的琼脂糖凝胶的浓度。 通常来说,DNA分子量越小,需要选择的胶浓度越高。分离小于0.5 kb的DNA片段所需胶浓度是1.2%至1.5%,分离大于10 kb的DNA分子所需胶浓度为0.3%至0.7%,DNA片段大小介于两者之间则所需胶浓度为0.8%至1.0%。
需要注意的是,低浓度凝胶很脆弱,难以操作,而高浓度凝胶则比较浑浊,会干扰DNA片段的可视化分析。
此外,电源电压、核酸嵌入染料以及离子强度也会影响DNA的迁移率。
在低电压时,线状DNA片段的迁移率与所加电压成正比。但是随着电压的增加,相对分子质量大的DNA片段迁移率的增加是有差别的,相对分子质量与迁移率之间可能偏离线性关系。因此,为了有效分离DNA片段,电压不宜超过5V/cm。
核酸染料也会影响DNA的迁移率,比如常用的荧光染料溴化乙啶会嵌入到DNA链堆积的碱基对之间,使线状DNA迁移率降低15%左右。
电泳过程中使用的电极缓冲液的成分和离子强度对DNA的迁移率也有影响,缺少离子时,例如误用蒸馏水配制凝胶,电流传导少,DNA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中,如误加了10×电泳缓冲液,电导会很高,导致大量热量产生,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液有TBE(Tris-硼酸)和TAE(Tris-乙酸)。
DNA的电泳受到的影响因素可真是不少呢,同学们在实验过程中要注意选择合适的琼脂糖浓度、染料、电泳缓冲液,设定合适的电压,这样才能得到一张漂亮的电泳图片。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试