当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 > SDS-PAGE电泳凝胶的染色
同学们好,上节课我们学习了SDS-PAGE的原理以及操作方法。电泳结束后,蛋白质条带用肉眼是看不到的,需要通过染色的方法才能显现出来,从而检测它们的大小、纯度和含量。蛋白质的染色液和染色方法都有哪些呢?这节课,我们就来学习SDS-PAGE电泳凝胶的染色。
电泳后有不同的染色方法,所用染色液的原理和灵敏度各不相同。实验室常用的蛋白质染色方法有考马斯亮蓝染色法以及银染法,我们称之为传统染色法。在传统染色法基础上也产生了一些改进的快速染色法,使染色更为方便、快速。蛋白质也可以采用荧光染色的方法,这种方法在蛋白质组学研究中使用较多。
考马斯亮蓝染色法是SDS-PAGE电泳后蛋白质染色最常用的方法。使用的染料是考马斯亮蓝R-250。考马斯亮蓝R-250中文名称是三苯基甲烷,能渗入凝胶,与蛋白质的碱性基团非共价结合,使蛋白质条带呈现蓝色。染料的结合量和蛋白质的量呈正比,因此可以测定蛋白质的含量。考马斯亮蓝检测的灵敏可达到10 ng。
考马斯亮蓝染色法需要染色液和脱色液。染色液对蛋白质条带进行固定和染色,染色液也会与凝胶以低亲和力结合,因此需要脱色液将凝胶背景处的染料去除,使蛋白质条带能清晰显示出来。
SDS-PAGE电泳结束后,取出凝胶,切去溴酚蓝前沿和浓缩胶后,将凝胶放入染色液中,放置在摇床上染色30 min以上,然后倒出染色液,染色液可以回收使用几次。凝胶用清水漂洗一次后,放入装有脱色液的容器中,摇床震荡脱色,到蛋白质条带清晰的时候就可以停止脱色了。脱色期间,需要更换3至4次脱色液。
实验室常用的另一种传统染色法是银染法,银染的方法很多,染色机制还不是很明确。可能是由染色液中的银离子与氨基酸侧链基团结合,随后,蛋白质条带上结合的银离子被还原为金属银,沉积在蛋白质条带上显色。银染法的灵敏度比考马斯亮蓝染色法高100倍以上,可检测低至0.1 ng的蛋白质条带。
与考马斯亮蓝染色法相比,银染操作步骤多,染色时间长。因为银染具有不同的染色方法,这里就不详细介绍染色过程了。感兴趣的同学们可以在实验指南上查找到银染的方法,选择省时、高效的银染方法。
为了提高染色的效率和效果,研究者也在不断对染色方法进行改进,通过改变染色液的成分提高染色的灵敏度,或者是在染色和脱色的过程中加热来缩短染色和脱色的时间。这里提供的就是一份通过微波炉加快染色和脱色过程的方案,可在半小时左右完成染色和脱色,与传统染色法数小时相比,大大缩短了染色的时间。现在各个公司也提供一些改良的考马斯亮蓝快速染色的试剂,同学们也可以选择使用。
蛋白质染色还可以采用荧光染色法,在蛋白质组学研究中应用比较多。荧光染料种类很多,不同染料原理及操作有所不同。它综合了考染法和银染法的优点,灵敏度与银染相当,可检测低至0.25 ng或1 ng左右的蛋白质条带,但是操作流程比银染简单。与考染和银染一样,荧光染色通常在电泳后进行,需要固定和脱色。凝胶用成像系统进行观察和拍照。
通过本节课的学习,我们了解了SDS-PAGE凝胶染色的传统方法,包括考染法和银染法,以及改进的快速染色法和荧光染色法,同学们可根据实验的要求和实验条件选择经济、高效的染色方法。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试