当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第三节 酶米氏常数的测定 > 淀粉酶米氏常数的测定和计算
学过生物化学的酶学部分
我们都已经了解了
底物浓度会影响酶促反应速率
而酶动力学的研究的核心就是底物
浓度与酶促反应速度变化的关系
从1913年两位科学家
提出M-M模型以后
1925年另外两位科学家
进一步完善了这个数学模型
建立了同学们已经熟悉的米氏方程
其中KM为米氏常数
Vmax为最大反应速率
S为底物浓度
V为反应速度
米氏常数KM是米氏酶的特征常数
同一个酶对不同的底物就有着不同的KM
其中KM越低
就意味着酶和这个底物的亲和力越大
所以通过测定KM就可以
判断出酶的最适底物
还可以通过KM来判断反应的方向
1934年
两位科学家进一步提出
将米氏方程取倒数后就推导出了这个公式
在这个公式中
KM比V max是一个常数
V max分之1也是一个常数
而酶促反应速率的倒数V分之1和
底物浓度的倒数S分之1都是变量
所以当配置一系列不同
底物浓度的反应体系
加入等量的酶后计算对应的反应速度
做图就可以得到一条直线
这条直线的纵轴截距等于1/Vmax
横轴的截距为1/KM
斜率为KM比V max
由此就可以计算出酶的KM和
V max两个重要常数
但是很多同学在实际测定和计算过程中
关于底物浓度和反应速度
的计算体系很容易混淆
所以我们这里以α-淀粉酶为例
一起来看一下如何用双倒数
作图法计算酶的米氏常数
我们以α-淀粉酶水解淀粉
利用352硝基水杨酸测定产物
麦芽糖浓度的方法为例
在这个反应中
我们要首先配置一系列不同浓度
的底物淀粉溶液三毫升
淀粉液用酶的最适反应溶剂体系配置
预热到40度
在每支试管中加入一毫升等温的酶液
反应5分钟后
在各管中均加入4毫升
氢氧化钠使反应终止
将8毫升的酶反应体系
中反应液转移一毫升
到新的试管中
与麦芽糖标准曲线一起加入
352硝基水杨酸一毫升
沸水浴5分钟
然后稀释定容到15毫升
利用可见分光光度计在520
纳米处测定吸光度值
根据一系列浓度梯度的麦芽糖标准曲线
与352硝基水杨酸反应生成的三氨基
五硝基水杨酸在520纳米处的吸光度值
我们可以计算出麦芽糖浓度
和吸光度的对应关系
接下来我们来看不同底物浓度的酶反应管
我们利用10毫克每毫升的淀粉
标准液和柠檬酸缓冲液
配制出一系列不同淀粉浓度的溶液
然后我们先计算公式中的底物浓度
所以第一个问题来了
底物浓度应该是淀粉加柠檬酸
的三毫升体系中的淀粉浓度
还是淀粉加柠檬酸
再加酶液的4毫升反应体系中的
浓度呢
注意和酶起反应的底物一定
是混合了酶液的底物
所以能体现差异的底物浓度
必须是既有底物又有酶液的
酶反应体系中的底物浓度
因此我们的计算方式就应该是淀粉的体积
乘以10毫克每毫升除以4毫升
并由此计算出底物浓度的倒数
我们对一系列不同浓度底物
的酶促反应管进行测定后
得到其产物在520纳米处的光吸收
可以计算出所测定的各管中麦芽糖的浓度
请注意计算1~10号管的麦芽糖浓度时
需要先扣除掉对照管的吸光度
因为这代表了体系背景的光吸收值
接下来第二个问题来了
通过与标准曲线对比计算出产物麦芽糖
浓度应该是加入淀粉酶和氢氧化钠
后总共8毫升体系中的产物浓度
而我们知道反应速度是单位
时间内生成产物的浓度
那么是不是计算出的浓度除以酶促
反应时间5分钟就是反应速度了
请注意产物浓度也应该是
酶反应体系中的产物浓度
也就是说要换算到只有淀粉和酶液的反应
体系中单位时间所生成的产物浓度
在米氏方程作图的过程中
只有底物和产物的浓度都以相同
的体系计算才有可比性
我们可以反过来想
如果关于反应速度的计算不用
换算为反应体系中的浓度
那么在反应终止的过程中
加入氢氧化钠的量变化
反应速度就会变化
这是不是很不合理呢
本实验中的反应体系是三毫升
淀粉加一毫升酶液的4毫升
而我们刚刚利用标准曲线计算的产物
浓度是三毫升淀粉加一毫升酶液
再加4毫升氢氧化钠
总共8毫升体系中的麦芽糖浓度
所以需要将浓度乘以8毫升再除以4毫升
得到的才是反应体系中生成的产物浓度
在此基础上除以反应时间
5分钟就可以得出反应速度
并进而求出反应速度的倒数
现在我们就计算出了不同
底物浓度下的反应速度
用底物浓度的倒数和速度的倒数
分别作为横纵坐标绘制双倒数图
并且得到直线的斜率和截距
现在考考你
5.6853和0.9978
这两个数各代表什么常数
如何计算KM和Vmax
根据双倒数作图的公式
我们可以知道纵轴的截距
应该等于1/Vmax
而斜率除以截距就等于KM的值
这就是米氏方程双倒数作图的基本过程
在设计和实施米氏方程双倒数
作图法求KM值的过程中
同学们要注意以下几点
首先是底部浓度设计的环节
在一定浓度范围内
为了计算方便和减少误差
可尽量避免选择倒数为无限循环小数
而且让倒数尽可能平均分配
此外无论是通过底物浓度
还是通过产物浓度计算反应速度
计算体系应该是酶反应体系
第三点是实际操作过程中应注意各个管
之间加入的酶液和终止反应的时间差
尽可能确保每一支试管中的反应时间一致
否则将难以得到准确的
KM和V max的数据
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试