当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第四章 酶活力的测定 >  第三节 酶米氏常数的测定 >  淀粉酶米氏常数的测定和计算

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频课程列表

淀粉酶米氏常数的测定和计算在线视频

下一节:淀粉酶米氏常数的测定和计算

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频列表

淀粉酶米氏常数的测定和计算课程教案、知识点、字幕

学过生物化学的酶学部分

我们都已经了解了

底物浓度会影响酶促反应速率

而酶动力学的研究的核心就是底物

浓度与酶促反应速度变化的关系

从1913年两位科学家

提出M-M模型以后

1925年另外两位科学家

进一步完善了这个数学模型

建立了同学们已经熟悉的米氏方程

其中KM为米氏常数

Vmax为最大反应速率

S为底物浓度

V为反应速度

米氏常数KM是米氏酶的特征常数

同一个酶对不同的底物就有着不同的KM

其中KM越低

就意味着酶和这个底物的亲和力越大

所以通过测定KM就可以

判断出酶的最适底物

还可以通过KM来判断反应的方向

1934年

两位科学家进一步提出

将米氏方程取倒数后就推导出了这个公式

在这个公式中

KM比V max是一个常数

V max分之1也是一个常数

而酶促反应速率的倒数V分之1和

底物浓度的倒数S分之1都是变量

所以当配置一系列不同

底物浓度的反应体系

加入等量的酶后计算对应的反应速度

做图就可以得到一条直线

这条直线的纵轴截距等于1/Vmax

横轴的截距为1/KM

斜率为KM比V max

由此就可以计算出酶的KM和

V max两个重要常数

但是很多同学在实际测定和计算过程中

关于底物浓度和反应速度

的计算体系很容易混淆

所以我们这里以α-淀粉酶为例

一起来看一下如何用双倒数

作图法计算酶的米氏常数

我们以α-淀粉酶水解淀粉

利用352硝基水杨酸测定产物

麦芽糖浓度的方法为例

在这个反应中

我们要首先配置一系列不同浓度

的底物淀粉溶液三毫升

淀粉液用酶的最适反应溶剂体系配置

预热到40度

在每支试管中加入一毫升等温的酶液

反应5分钟后

在各管中均加入4毫升

氢氧化钠使反应终止

将8毫升的酶反应体系

中反应液转移一毫升

到新的试管中

与麦芽糖标准曲线一起加入

352硝基水杨酸一毫升

沸水浴5分钟

然后稀释定容到15毫升

利用可见分光光度计在520

纳米处测定吸光度值

根据一系列浓度梯度的麦芽糖标准曲线

与352硝基水杨酸反应生成的三氨基

五硝基水杨酸在520纳米处的吸光度值

我们可以计算出麦芽糖浓度

和吸光度的对应关系

接下来我们来看不同底物浓度的酶反应管

我们利用10毫克每毫升的淀粉

标准液和柠檬酸缓冲液

配制出一系列不同淀粉浓度的溶液

然后我们先计算公式中的底物浓度

所以第一个问题来了

底物浓度应该是淀粉加柠檬酸

的三毫升体系中的淀粉浓度

还是淀粉加柠檬酸

再加酶液的4毫升反应体系中的

浓度呢

注意和酶起反应的底物一定

是混合了酶液的底物

所以能体现差异的底物浓度

必须是既有底物又有酶液的

酶反应体系中的底物浓度

因此我们的计算方式就应该是淀粉的体积

乘以10毫克每毫升除以4毫升

并由此计算出底物浓度的倒数

我们对一系列不同浓度底物

的酶促反应管进行测定后

得到其产物在520纳米处的光吸收

可以计算出所测定的各管中麦芽糖的浓度

请注意计算1~10号管的麦芽糖浓度时

需要先扣除掉对照管的吸光度

因为这代表了体系背景的光吸收值

接下来第二个问题来了

通过与标准曲线对比计算出产物麦芽糖

浓度应该是加入淀粉酶和氢氧化钠

后总共8毫升体系中的产物浓度

而我们知道反应速度是单位

时间内生成产物的浓度

那么是不是计算出的浓度除以酶促

反应时间5分钟就是反应速度了

请注意产物浓度也应该是

酶反应体系中的产物浓度

也就是说要换算到只有淀粉和酶液的反应

体系中单位时间所生成的产物浓度

在米氏方程作图的过程中

只有底物和产物的浓度都以相同

的体系计算才有可比性

我们可以反过来想

如果关于反应速度的计算不用

换算为反应体系中的浓度

那么在反应终止的过程中

加入氢氧化钠的量变化

反应速度就会变化

这是不是很不合理呢

本实验中的反应体系是三毫升

淀粉加一毫升酶液的4毫升

而我们刚刚利用标准曲线计算的产物

浓度是三毫升淀粉加一毫升酶液

再加4毫升氢氧化钠

总共8毫升体系中的麦芽糖浓度

所以需要将浓度乘以8毫升再除以4毫升

得到的才是反应体系中生成的产物浓度

在此基础上除以反应时间

5分钟就可以得出反应速度

并进而求出反应速度的倒数

现在我们就计算出了不同

底物浓度下的反应速度

用底物浓度的倒数和速度的倒数

分别作为横纵坐标绘制双倒数图

并且得到直线的斜率和截距

现在考考你

5.6853和0.9978

这两个数各代表什么常数

如何计算KM和Vmax

根据双倒数作图的公式

我们可以知道纵轴的截距

应该等于1/Vmax

而斜率除以截距就等于KM的值

这就是米氏方程双倒数作图的基本过程

在设计和实施米氏方程双倒数

作图法求KM值的过程中

同学们要注意以下几点

首先是底部浓度设计的环节

在一定浓度范围内

为了计算方便和减少误差

可尽量避免选择倒数为无限循环小数

而且让倒数尽可能平均分配

此外无论是通过底物浓度

还是通过产物浓度计算反应速度

计算体系应该是酶反应体系

第三点是实际操作过程中应注意各个管

之间加入的酶液和终止反应的时间差

尽可能确保每一支试管中的反应时间一致

否则将难以得到准确的

KM和V max的数据

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

淀粉酶米氏常数的测定和计算笔记与讨论

收藏文章
表情删除后不可恢复,是否删除
取消
确定
图片正在上传,请稍后...
  • 评分:
评论内容为空!
还没有评论,快来抢沙发吧!

也许你还感兴趣的课程:

© 柠檬大学-慕课导航 课程版权归原始院校所有,
本网站仅通过互联网进行慕课课程索引,不提供在线课程学习和视频,请同学们点击报名到课程提供网站进行学习。
欢迎学习『淀粉酶米氏常数的测定和计算慕课视频播放-基础生物化学实验-MOOC慕课视频教程-柠檬大学』