当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 >  第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 >  SDS-PAGE电泳的原理

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频课程列表

SDS-PAGE电泳的原理在线视频

下一节:SDS-PAGE电泳的原理

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频列表

SDS-PAGE电泳的原理课程教案、知识点、字幕

同学们好

生物体内存在着大大小小

功能不同的蛋白质

比如我们熟悉的血红蛋白

胰岛素等等

如果想要了解蛋白质的结构与功能

首先需要对它进行分离

今天我们要学习的

SDS-PAGE

就是可以分离蛋白质的一种技术

除了可以分离蛋白之外

还可以对蛋白质进行定量以及

测定蛋白质分子量大小

上节课我们了解了

聚丙烯酰胺凝胶的组成和特性

SDS-PAGE

又是什么

它是怎样达到分离蛋白质的目的的

今天我们就来学习

SDS-PAGE

电泳的原理

SDS-PAGE

又称为

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

是以聚丙烯酰胺凝胶及配置作为

支持介质的一种电泳方法

SDS-PAGE

是实验室常用的一项技术

可以进行蛋白质的分离

纯化定量及分子量测定等

在SDS-PAGE

的基础上

还可以进行免疫印迹

双向电泳等实验

通过SDS-PAGE

分离和测定蛋白质分子量时

样品缓冲液中含有

SDS

和断裂二硫键的还原剂

如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT

他们都有什么作用呢

SDS

的中文名称是十二烷基硫酸钠

它是一种阴离子去污剂

带有大量的负电荷

当SDS

与蛋白质结合时

所带的负电荷

消除了不同种类蛋白质

原有电荷的差异

SDS

按照一定比例与蛋白质结合

破坏维持蛋白质空间构象的次级键

改变了蛋白质的构象

使蛋白质的形状呈现长的椭圆棒状

不同SDS

蛋白质复合体的短轴长度都是一样的

大约为1.8纳米

长轴长度与蛋白质的分子

量成正比例关系

样品缓冲液中的还原剂通常是

β-巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT

它们能使蛋白质 半胱氨酸

残基之间的二硫键断裂

使蛋白质解聚为亚基

或单肽链

有助于

SDS

与蛋白质的充分结合

经过SDS

和还原剂处理后

蛋白质的迁移率不受原有

电荷和形状的影响

只与蛋白质的分子大小有关

这就是

SDS能够

用来测量蛋白质分子质量的原因了

需要注意的是

对于寡聚蛋白质来说

SDS-PAGE

测定的不是蛋白质的完整分子量

而是亚基的分子量

聚丙烯酰胺凝胶电泳根据

是否有浓缩效应

分为连续系统和不连续系统

连续系统使用相同孔径

的凝胶和缓冲系统

不连续系统中存在不同孔径

的凝胶和不同的缓冲系统

不连续系统分辨率高

它具有三种效应

浓缩效应 电荷效应和分子筛效应

因为电荷效应和分子筛效应

在其他电泳系统中也存在

因此在这里我们主要介绍浓缩效应

浓缩效应是因为不连续凝胶系统

中具有凝胶孔径的不连续

缓冲液离子成分及ph的不连续性

首先来看凝胶孔径的不连续性

凝胶的下层是浓度高

孔径小的分离胶

上层是浓度低 孔径大的浓缩胶

电泳系统中还存在缓冲液离子

成分和ph的不连续性

整个电泳体系中有浓缩胶缓冲液

分离胶

缓冲液和电极缓冲液

浓缩胶和分离胶的缓冲

液都含有Tris-HCl

但ph值是不同的

浓缩胶的缓冲液ph是6.7

分离胶缓冲液ph值是8.9

他们和ph值8.3的

Tris-HCl电极缓冲液

共同组成了一个凝胶的不连续系统

浓缩胶的孔径大在浓缩

胶中以浓缩效应为主

主要是将蛋白质样品

压缩成很窄的条带

然后在孔径较小的分离胶中

通过分子筛效应

将蛋白质按照分子量大小进行分离

通过刚才的介绍

我们已经了解到浓缩胶 缓冲液

分离胶

缓冲液和电极缓冲液的

ph值和成分是不同的

这种不同的ph值和成分在蛋白质的

浓缩和分离中起到了怎样的作用呢

电极缓冲液 浓缩胶

缓冲液和分离胶缓冲液

中都含有Tris及HCl

Tris是缓冲配对离子

 HCl在整个系统中都能解离出

氯离子图中我们用蓝色

小球表示氯离子

它在电场中迁移最快

称为快离子或先导离子

电泳开始时蛋白质样品再加样孔里

此时的缓冲液是ph值

8.3的电极缓冲液

氯离子在电场中快速向正极移动

电极缓冲液中甘氨酸的等电点为6.0

在电场中解离为甘氨酸

阴离子向正极移动

途中用绿色方块表示

蛋白质带负电荷

向正极移动图中用不同

颜色的椭圆棒状表示

当氯离子 甘氨酸及蛋白质迁移进入

ph值6.7的浓缩胶后

氯离子继续快速向前移动

此时缓冲液的ph值

接近甘氨酸的等电点

因此甘氨酸解离度很小

在电场中迁移最慢成为

慢离子或尾随离子

蛋白质的迁移率介于快慢离子之间

在电场作用下

氯离子快速向前涌动

会在后面形成一个离子浓度

低的区域即低电导区

而电导率与电位梯度成反比

因此低电导区具有了高电位梯度

这种高电位梯度推动着蛋白质

和慢离子快速移动

蛋白质就被压缩成了一条线

所有蛋白质站在同一起跑线上

当进入分离胶之后

缓冲液的ph是8.9

甘氨酸的解离度增大

泳动速度变快

因为它的分子量要远小于蛋白质

所以它会超越蛋白质

浓缩效应消失

蛋白质就根据分子量大小

在凝胶中进行分离

最后要注意的一点是

浓缩胶的浓度很低

这是为了减少凝胶对蛋白质

的分子筛效应

在浓缩胶中以浓缩效应为主

分离胶浓度加大

通过分子筛效应实现对蛋白质的分离

有了浓缩效应

再加上电荷效应和分子筛效应

SDS-PAGE的不连续

系统在分离效果和分辨率

方面就有了很大的提升

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

SDS-PAGE电泳的原理笔记与讨论

也许你还感兴趣的课程:

© 柠檬大学-慕课导航 课程版权归原始院校所有,
本网站仅通过互联网进行慕课课程索引,不提供在线课程学习和视频,请同学们点击报名到课程提供网站进行学习。