当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 > SDS-PAGE电泳的原理
同学们好
生物体内存在着大大小小
功能不同的蛋白质
比如我们熟悉的血红蛋白
胰岛素等等
如果想要了解蛋白质的结构与功能
首先需要对它进行分离
今天我们要学习的
SDS-PAGE
就是可以分离蛋白质的一种技术
除了可以分离蛋白之外
还可以对蛋白质进行定量以及
测定蛋白质分子量大小
上节课我们了解了
聚丙烯酰胺凝胶的组成和特性
SDS-PAGE
又是什么
它是怎样达到分离蛋白质的目的的
今天我们就来学习
SDS-PAGE
电泳的原理
SDS-PAGE
又称为
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
是以聚丙烯酰胺凝胶及配置作为
支持介质的一种电泳方法
SDS-PAGE
是实验室常用的一项技术
可以进行蛋白质的分离
纯化定量及分子量测定等
在SDS-PAGE
的基础上
还可以进行免疫印迹
双向电泳等实验
通过SDS-PAGE
分离和测定蛋白质分子量时
样品缓冲液中含有
SDS
和断裂二硫键的还原剂
如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT
他们都有什么作用呢
SDS
的中文名称是十二烷基硫酸钠
它是一种阴离子去污剂
带有大量的负电荷
当SDS
与蛋白质结合时
所带的负电荷
消除了不同种类蛋白质
原有电荷的差异
SDS
按照一定比例与蛋白质结合
破坏维持蛋白质空间构象的次级键
改变了蛋白质的构象
使蛋白质的形状呈现长的椭圆棒状
不同SDS
蛋白质复合体的短轴长度都是一样的
大约为1.8纳米
二
长轴长度与蛋白质的分子
量成正比例关系
样品缓冲液中的还原剂通常是
β-巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT
它们能使蛋白质 半胱氨酸
残基之间的二硫键断裂
使蛋白质解聚为亚基
或单肽链
有助于
SDS
与蛋白质的充分结合
经过SDS
和还原剂处理后
蛋白质的迁移率不受原有
电荷和形状的影响
只与蛋白质的分子大小有关
这就是
SDS能够
用来测量蛋白质分子质量的原因了
需要注意的是
对于寡聚蛋白质来说
SDS-PAGE
测定的不是蛋白质的完整分子量
而是亚基的分子量
聚丙烯酰胺凝胶电泳根据
是否有浓缩效应
分为连续系统和不连续系统
连续系统使用相同孔径
的凝胶和缓冲系统
不连续系统中存在不同孔径
的凝胶和不同的缓冲系统
不连续系统分辨率高
它具有三种效应
浓缩效应 电荷效应和分子筛效应
因为电荷效应和分子筛效应
在其他电泳系统中也存在
因此在这里我们主要介绍浓缩效应
浓缩效应是因为不连续凝胶系统
中具有凝胶孔径的不连续
缓冲液离子成分及ph的不连续性
首先来看凝胶孔径的不连续性
凝胶的下层是浓度高
孔径小的分离胶
上层是浓度低 孔径大的浓缩胶
电泳系统中还存在缓冲液离子
成分和ph的不连续性
整个电泳体系中有浓缩胶缓冲液
分离胶
缓冲液和电极缓冲液
浓缩胶和分离胶的缓冲
液都含有Tris-HCl
但ph值是不同的
浓缩胶的缓冲液ph是6.7
分离胶缓冲液ph值是8.9
他们和ph值8.3的
Tris-HCl电极缓冲液
共同组成了一个凝胶的不连续系统
浓缩胶的孔径大在浓缩
胶中以浓缩效应为主
主要是将蛋白质样品
压缩成很窄的条带
然后在孔径较小的分离胶中
通过分子筛效应
将蛋白质按照分子量大小进行分离
通过刚才的介绍
我们已经了解到浓缩胶 缓冲液
分离胶
缓冲液和电极缓冲液的
ph值和成分是不同的
这种不同的ph值和成分在蛋白质的
浓缩和分离中起到了怎样的作用呢
电极缓冲液 浓缩胶
缓冲液和分离胶缓冲液
中都含有Tris及HCl
Tris是缓冲配对离子
HCl在整个系统中都能解离出
氯离子图中我们用蓝色
小球表示氯离子
它在电场中迁移最快
称为快离子或先导离子
电泳开始时蛋白质样品再加样孔里
此时的缓冲液是ph值
8.3的电极缓冲液
氯离子在电场中快速向正极移动
电极缓冲液中甘氨酸的等电点为6.0
在电场中解离为甘氨酸
阴离子向正极移动
途中用绿色方块表示
蛋白质带负电荷
向正极移动图中用不同
颜色的椭圆棒状表示
当氯离子 甘氨酸及蛋白质迁移进入
ph值6.7的浓缩胶后
氯离子继续快速向前移动
此时缓冲液的ph值
接近甘氨酸的等电点
因此甘氨酸解离度很小
在电场中迁移最慢成为
慢离子或尾随离子
蛋白质的迁移率介于快慢离子之间
在电场作用下
氯离子快速向前涌动
会在后面形成一个离子浓度
低的区域即低电导区
而电导率与电位梯度成反比
因此低电导区具有了高电位梯度
这种高电位梯度推动着蛋白质
和慢离子快速移动
蛋白质就被压缩成了一条线
所有蛋白质站在同一起跑线上
当进入分离胶之后
缓冲液的ph是8.9
甘氨酸的解离度增大
泳动速度变快
因为它的分子量要远小于蛋白质
所以它会超越蛋白质
浓缩效应消失
蛋白质就根据分子量大小
在凝胶中进行分离
最后要注意的一点是
浓缩胶的浓度很低
这是为了减少凝胶对蛋白质
的分子筛效应
在浓缩胶中以浓缩效应为主
分离胶浓度加大
通过分子筛效应实现对蛋白质的分离
有了浓缩效应
再加上电荷效应和分子筛效应
SDS-PAGE的不连续
系统在分离效果和分辨率
方面就有了很大的提升
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试