当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀
同学们大家好
在这个视频中
我将要讲解蛋白质分离
纯化常见技术
有机溶剂沉淀和等电点沉淀
依据溶解度进行蛋白质
分离纯化的技术
包括盐析有机溶剂沉淀
等电点沉淀
上一个视频我们了解了盐析
和盐析操作的注意事项
今天我将介绍有机溶剂沉淀
和蛋白质等电点沉淀
利用要分离的物质和其他杂质
在有机溶剂中的溶解度不同
通过添加一定量的特定有机溶剂
使某种蛋白质沉淀析出
从而与其他组分分离的方法
被称为有机溶剂沉淀法
谈到有机溶剂沉淀就一定
会涉及到介电常数
介电常数是由物质的属性决定的
例如20℃时丙酮的
介电常数是21.4
而水的介电常数是80
如图所示
分母中的ε就是介电常数
可以看出
随着ε的减小
带电分子之间的相互作用
F会增加
有机溶剂引起蛋白质沉淀
主要原因是降低了蛋白质
溶液的介电常数
溶液介电常数的降低
会增加蛋白质分子之间的相互作用
而使其聚集沉淀
有机溶剂引起蛋白质沉淀的
另一个原因与盐析相似
有机溶剂能够与蛋白质直接
争夺溶液中的水分子
导致蛋白质分子水化膜被破坏
分子之间互作增强 聚集 沉淀
常用的有机溶剂有 甲醇
乙醇和丙酮
他们能够与水相溶
能够显著降低蛋白质在水中的溶解度
但是注意在室温下
有机溶剂在降低蛋白质溶解度的同时
还会引发蛋白质的变性
沉淀
丙酮是有机溶剂
在蛋白质分离
纯化过程中常用来沉淀蛋白质
此外
丙酮含有去除蛋白质
提取过程中的色素
膜
脂等杂质的作用
但是值得注意的是
为了防止蛋白质变性沉淀的发生
在进行丙酮沉淀 蛋白质的操作时
丙酮一定要预先冷冻处理
此外其他物质也能够沉淀蛋白质
例如
聚乙二醇 PEG
它就具有脱去蛋白质水化层
浓缩蛋白质的作用
下面我将介绍另外一种改变溶解度
沉淀蛋白质的方法
等电点沉淀法
蛋白质是带有正负电荷的两性电解质
其带电基团的数量和性质
随着蛋白质溶液的pH值
不同而发生变化
当某种蛋白质净电荷为零时
此时蛋白质溶液的pH值
就是该蛋白质的等电点
用pI表示
通常在pI值下
蛋白质在溶液中的溶解度最低
研究人员可以利用蛋白质在其
等电点溶解度最低这一性质
来分离纯化目标蛋白
当蛋白溶液的pH值达到
目标蛋白等电点时
该蛋白质分子由于净电荷为零
导致蛋白质分子之间静电排斥力降低
致使它们之间的相互作用达到最强
从而聚集沉淀从溶液中沉淀下来
什么时候选用等电点沉淀
法进行蛋白质分离纯化
实际上
当目标蛋白的等电点与蛋白
提取缓冲液的pH值
相差很大时
用等电点沉淀目标蛋白
是比较容易成功的
这里我再次强调
当蛋白质溶液pH值小于其等电点时
蛋白质带正电
当蛋白溶液pH值等于
其等电点pI时
蛋白质净电荷为0
溶解度最低
当蛋白质溶液大于其等电点时
蛋白质 带负电
例如碱性蛋白质溶菌酶
其等电点为11
在酸性条件下或者是低
pH条件下带正电荷
呈现溶解状态
而在高pH条件下
达到等电点时发生沉淀
而酸性蛋白质与之相反
以卵清蛋白为例
其等电点是pH4.6
在碱性条件下
即高pH条件下
该蛋白质带负电
呈现溶解状态
在低pH条件下
假如pH为4.6
则蛋白质发生沉淀
相信你听说过牛乳经济掺假的事件
所谓牛乳经济掺假
通常是指在牛乳中掺入廉价的组分
除了有毒化工原料三聚氰胺外
主要的经济掺假蛋白
原料包括乳清粉
明胶和大豆分离蛋白粉
如何判断是否牛乳经济掺假呢?
是否可以考虑测定牛乳
中的特定蛋白组分
依据该组分的含量来判断?
有文献报道可以用牛乳中的酪蛋白
含量来判断经济掺假
通常酪蛋白在牛乳乳蛋白中的
占比维持在77~78%
因此酪蛋白可以作为牛乳中
特征成分进行检测
又如何测定牛乳中 酪蛋白的含量呢
可以利用等电点沉淀法
牛乳蛋白质主要包括
酪蛋白和乳清蛋白
酪蛋白的等电点是pH4.6
正常牛乳的pH值为6.6~6.8
因此酪蛋白胶粒在牛乳中
以负电荷的形式存在
在牛乳中加入酸性物质
调节pH值达到酪蛋白等电点
此时酪蛋白以及夹杂物就
会以沉淀的形式析出
通过离心分离获得酪蛋白沉淀粗品
再通过其他方法将酪蛋白和杂质分开
最后即可得到纯品的酪蛋白
研究人员在酪蛋白沉淀检测方法及其
在牛乳经济掺假鉴定中的应用
一文中描述了等电点沉淀
法提取酪蛋白的过程
从图中可以看出
在烧杯中有100mL牛乳
溶液pH值为6.6~6.8
可以加入10%的醋酸溶液
调节烧杯中的牛乳 溶液
pH值为4.6
当蛋白质沉淀后
将烧杯中溶液转入离心管中
3000rpm离心15分钟
离心管中的沉淀即为酪蛋白粗品
之后可以通过应用其他
技术获得纯品酪蛋白
文献中指出
从理论上讲
可以将酪蛋白质量分数大于
等于73%作为牛乳
掺假检验的定量指标
从文章的检验结果可知
酪蛋白等电点沉淀法能够有效检测出
牛乳中乳清粉和明胶的掺假行为
但是无法准确检测出
蛋白粉的掺假行为
以上是本视频的主要内容
下面我对本视频进行小结
在这个视频中
我首先介绍了有机溶剂
沉淀蛋白质的原理
常用的有机溶剂种类
之后讲解了等电点沉淀蛋白质的原理
下一个视频我将与大家讨论依据
蛋白质带电荷性质进行分离的方法
离子交换层析技术
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
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--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
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--亲和层析
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--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试