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IMAC亲和层析技术的基本步骤课程教案、知识点、字幕

之前我讲解了固定化金属离子亲和

层析IMAC技术的原理

现在我将向大家介绍这项

技术的基本操作步骤

在实际工作当中

用Ni亲和柱分离纯化多聚组氨酸

标记融合蛋白的技术很常用

图片显示的是购买的商品化

的IMAC的柱填料

这种柱填料是前面提到的

凝胶和配基偶联的介质

Sepharose

该产品是GE Healthcare 

公司生产的Chelating Sepharose 

Fast Flow系列产品之一

利用IMAC技术分离

纯化多聚组氨酸标记

融合蛋白

包括以下几个过程

亲和柱制备

平衡上样

清洗未结合亲和柱的蛋白质

洗脱目标蛋白质 亲和柱的再生等等

让我们首先看看装柱

图片显示的是层析柱的几个部分

从左到右依次是层析柱的下面盖子

柱体以及柱底部的垫片

在实验室中常常选择

1mL的层析柱装柱

商品填料是用20%乙醇浸泡的凝胶

使用时摇匀

用移液器吸取1mL

加入到去离子水冲洗过的

加了垫片的柱中

在重力的作用下

明胶颗粒自然下沉

形成均匀的柱床

用至少2倍体积的

去离子水清洗层析柱

之后将1mol/L的硫酸镍

1mL 加入到柱中

收集流出的溶液

重新加入柱中

重复三次

以保证足够的

镍离子与柱介质结合

之后继续向柱中加入

10mL 去离子水清洗

没有与柱介质结合的多余的镍离子

如图片所示

蓝色的部分就是结合了

镍离子的柱凝胶

装柱完成后需要平衡柱子

以达到与即将上样样品相同的缓冲体系

加入10mL 平衡缓冲液

充分平衡柱床

待缓冲液全部进入柱床后

盖上柱下面管口的盖子

停止平衡过程

平衡完成后开始上样

用移液器将蛋白质样品溶液缓慢

沿壁加入柱中

值得强调的是样品的制备环节

注意要在含有样品的

溶液中尽可能保持

没有乙二胺四乙酸

也就是没有EDTA

没有柠檬酸

没有高浓度的具有竞争

性结合的一级铵

咪唑 组氨酸等

以免影响

样品与柱介质上金属离子的结合

加样完毕后开始清洗

在柱中加入10mL 清洗缓冲液

洗脱去除不与柱介质紧密

结合的各种蛋白

收集流出的液体标记为杂蛋白

待缓冲液全部进入柱床后盖上盖子

停止清洗

杂蛋白洗脱完毕后

在柱中加入10mL 清洗缓冲液

将目标蛋白从柱介质上洗脱下来

在柱下端收集洗脱液标记为目标蛋白

待缓冲液全部进入柱床后

盖上盖子停止洗脱

获得目标蛋白后

需要对镍柱进行后处理

通常情况下是向柱中加入10mL

含500mmol/L咪唑的缓冲液

彻底清洗柱介质上的结合蛋白

待缓冲液全部进入柱床后

再用10mL 去离子水继续洗脱

洗脱结束后再加入去

离子水覆盖柱介质

将柱下部

管口的盖子盖好4℃保存

以备下次使用

同学们现在是否又有疑惑了

为什么后处理柱子需要加入500

mmol/L咪唑的缓冲液

记得前面我曾谈到过

亲和层析技术中常见目标蛋白

洗脱方式主要包括两种

一种是通过改变洗脱液的pH值

离子强度或者缓冲液组成来洗脱

结合在柱介质上的目标蛋白

另一种是用含有高浓度

配基的洗脱溶液

洗脱结合在柱介质上的目标蛋白

这里就是利用了第二种方式

此时的咪唑就相当于配基

通常用于目标蛋白洗脱缓冲液中

的咪唑浓度是300mmol/L

而再生柱时用的缓冲液密度

浓度是500mmol/L

如此操作的目的是通过

增加咪唑的浓度

以便更好的彻底洗脱结合

在柱介质上的蛋白质

此时你是不是还有疑惑

感觉镍柱后处理过于简单

你的疑惑是有道理的

其实用镊柱分离纯化

不同类型的蛋白柱的再生方法也不同

你可以依据所分离的蛋白特点

查阅相关资料进行柱的再生

这里就不再赘述了

以上是本视频的主要内容

在这个视频中

我首先介绍了多聚组氨酸

标记融合蛋白

分离纯化的基本操作过程

其次说明了样品准备的注意事项

谢谢大家的参与

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

IMAC亲和层析技术的基本步骤笔记与讨论

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