当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > IMAC亲和层析技术的基本步骤
之前我讲解了固定化金属离子亲和
层析IMAC技术的原理
现在我将向大家介绍这项
技术的基本操作步骤
在实际工作当中
用Ni亲和柱分离纯化多聚组氨酸
标记融合蛋白的技术很常用
图片显示的是购买的商品化
的IMAC的柱填料
这种柱填料是前面提到的
凝胶和配基偶联的介质
Sepharose
该产品是GE Healthcare
公司生产的Chelating Sepharose
Fast Flow系列产品之一
利用IMAC技术分离
纯化多聚组氨酸标记
融合蛋白
包括以下几个过程
亲和柱制备
平衡上样
清洗未结合亲和柱的蛋白质
洗脱目标蛋白质 亲和柱的再生等等
让我们首先看看装柱
图片显示的是层析柱的几个部分
从左到右依次是层析柱的下面盖子
柱体以及柱底部的垫片
在实验室中常常选择
1mL的层析柱装柱
商品填料是用20%乙醇浸泡的凝胶
使用时摇匀
用移液器吸取1mL
加入到去离子水冲洗过的
加了垫片的柱中
在重力的作用下
明胶颗粒自然下沉
形成均匀的柱床
用至少2倍体积的
去离子水清洗层析柱
之后将1mol/L的硫酸镍
1mL 加入到柱中
收集流出的溶液
重新加入柱中
重复三次
以保证足够的
镍离子与柱介质结合
之后继续向柱中加入
10mL 去离子水清洗
没有与柱介质结合的多余的镍离子
如图片所示
蓝色的部分就是结合了
镍离子的柱凝胶
装柱完成后需要平衡柱子
以达到与即将上样样品相同的缓冲体系
加入10mL 平衡缓冲液
充分平衡柱床
待缓冲液全部进入柱床后
盖上柱下面管口的盖子
停止平衡过程
平衡完成后开始上样
用移液器将蛋白质样品溶液缓慢
沿壁加入柱中
值得强调的是样品的制备环节
注意要在含有样品的
溶液中尽可能保持
没有乙二胺四乙酸
也就是没有EDTA
没有柠檬酸
没有高浓度的具有竞争
性结合的一级铵
咪唑 组氨酸等
以免影响
样品与柱介质上金属离子的结合
加样完毕后开始清洗
在柱中加入10mL 清洗缓冲液
洗脱去除不与柱介质紧密
结合的各种蛋白
收集流出的液体标记为杂蛋白
待缓冲液全部进入柱床后盖上盖子
停止清洗
杂蛋白洗脱完毕后
在柱中加入10mL 清洗缓冲液
将目标蛋白从柱介质上洗脱下来
在柱下端收集洗脱液标记为目标蛋白
待缓冲液全部进入柱床后
盖上盖子停止洗脱
获得目标蛋白后
需要对镍柱进行后处理
通常情况下是向柱中加入10mL
含500mmol/L咪唑的缓冲液
彻底清洗柱介质上的结合蛋白
待缓冲液全部进入柱床后
再用10mL 去离子水继续洗脱
洗脱结束后再加入去
离子水覆盖柱介质
将柱下部
管口的盖子盖好4℃保存
以备下次使用
同学们现在是否又有疑惑了
为什么后处理柱子需要加入500
mmol/L咪唑的缓冲液
记得前面我曾谈到过
亲和层析技术中常见目标蛋白
洗脱方式主要包括两种
一种是通过改变洗脱液的pH值
离子强度或者缓冲液组成来洗脱
结合在柱介质上的目标蛋白
另一种是用含有高浓度
配基的洗脱溶液
洗脱结合在柱介质上的目标蛋白
这里就是利用了第二种方式
此时的咪唑就相当于配基
通常用于目标蛋白洗脱缓冲液中
的咪唑浓度是300mmol/L
而再生柱时用的缓冲液密度
浓度是500mmol/L
如此操作的目的是通过
增加咪唑的浓度
以便更好的彻底洗脱结合
在柱介质上的蛋白质
此时你是不是还有疑惑
感觉镍柱后处理过于简单
你的疑惑是有道理的
其实用镊柱分离纯化
不同类型的蛋白柱的再生方法也不同
你可以依据所分离的蛋白特点
查阅相关资料进行柱的再生
这里就不再赘述了
以上是本视频的主要内容
在这个视频中
我首先介绍了多聚组氨酸
标记融合蛋白
分离纯化的基本操作过程
其次说明了样品准备的注意事项
谢谢大家的参与
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-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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