当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 离子交换层析
同学们大家好
这个视频我将要介绍
蛋白质分离纯化常见技术
离子交换层析
依赖于带电性质进行蛋白质分离
纯化的常见方法有等电点沉淀
离子交换层析和电泳
等电点沉淀
已经在前面的视频中进行了介绍
电泳技术将在以后电泳
部分进行专门的讲解
这里我将介绍离子交换层析技术
在介绍离子交换层析技术之前
首先介绍
柱层析
它是分离纯化蛋白质的有效技术
柱层析系统由固定相和流动相组成
习惯上人们将
层析柱中的固相支持介质
柱填料称为固定相
将穿过支持介质的流动溶液
成为流动相
层析法也称色谱法
混合物中各组分由于其物理化学
性质存在差异
他们在两项中的分布程度不同
在柱中的移动速度就不同
研究人员可以分部收集不同组分
从而达到获得目标组分的目的
研究人员常常运用离子交换层析
凝胶过滤层析 亲和层析 吸附层析
疏水层析
技术
这里我首先向同学们介绍
离子交换层析技术
层析柱中的离子交换剂上
具有可解离的基团,解离后的带电基团
能够与待分离的混合物中
带有与之相反电荷的
各蛋白组分相结合
结合能力与各蛋白组分所带电荷相关
研究人员将待分离混合物加入层析
柱中,混合物与交换剂进行结合
之后经过洗脱液 洗脱 分布
收集等过程
可获得各组分蛋白
从而达到分离纯化蛋白质的目的
这种方法就是离子交换层析技术
常见的分离纯化蛋白质的离子交换剂
包括阴离子和阳离子交换剂两大类
常见的离子交换剂有弱阴离子交换剂
强阴离子交换剂
弱阳离子交换剂和强阳离子交换剂
如图所示
图一上半部分是阴离子交换剂
二乙基氨基乙基纤维素
简称DEAE-纤维素
和季胺树脂Q
在一定pH范围内
它们能够解离出带负电荷的离子
之后自身带有正电荷
可以与带负电荷的蛋白组分结合
图1下半部分是阳离子交换剂
羧甲基纤维素
简称CM-纤维素和磺酸树脂S
在特定pH范围
它们可以解离出正电荷
而自身带负电荷
因此可以与带正电荷
的蛋白质组分结合
以羧甲基纤维素CM-纤维素为例
如图所示
它能够解离出带正电荷的离子之后
自身带有负电荷
可以与带正电荷的蛋白组分结合
由于DEAE-纤维素和CM-纤维素
所带的功能基团
分别能够在pH大于10时
或者pH小于4时
才能发生解离
所以两者被称为弱阴阳离子交换剂
而Q和S在水溶液中几乎
一直保持解离状态
所以被称为强的阴阳离子交换剂
例如采用阳离子交换剂分离
含有三种蛋白质的混合物
当混合物溶液pH值小于
三种蛋白质的等电点
此时所有蛋白质带正电荷
首先将混合物样品加入层析柱
由于
层析柱填料是阳离子交换剂
解离后带负电荷
它可以和三种带正电荷
的蛋白质都结合
但是依据蛋白质带电性质不同
结合强弱也不同
如图所示
红色表示的蛋白质带正电荷最少
蓝色表示的蛋白质带正电荷最多
紫色代表的蛋白质带电荷居中
将样品加入到层析柱中
三种蛋白质由于带有正电荷
都能够与层析柱中的
离子交换介质结合
先采用低盐浓度洗脱液进行洗脱
由于盐离子和蛋白质竞争
性地结合离子交换剂
所以在洗脱过程中
如图A所示与离子交换剂结合
最松弛的蛋白质组分
红色表示的蛋白质组分
被盐离子置换出来
先被洗脱下来
如图B所示紫色和蓝色
表示的蛋白质组分
由于带电性质不同
导致其与离子交换剂结合能力不同
因而在洗脱时它们在柱
中的下移速度不同
因而渐渐分开
结合能力最强的蓝色
蛋白组分走得最慢
如图C所示
最后通过增加盐的浓度
可将与离子交换剂结合最强
的蓝色蛋白质也洗脱下来
考虑到蛋白质在不同pH值
溶液中带电荷性质不同
可知不同pH条件下
混合物中各蛋白组分与离子交换
剂结合紧密程度也不同
因此也可以通过调节洗脱液的
pH值对混合物进行洗脱
以期达到分离的目的
很多情况下研究人员常同时
考虑盐浓度和pH值
采用两者的不同组合进行洗脱
以期达到更好的分离效果
通常情况下蛋白质并不带有颜色
人们是如何获知蛋白质从
层析柱中流出与否?
记得之前曾了解了蛋白质具有
280nm紫外吸收特性吗?
对了
可以利用紫外检测仪来
检测蛋白质是否出现
当蛋白质出现时
在紫外检测仪上会出现下面的洗脱峰
该图纵坐标表示蛋白质含量
横坐标表示洗脱体积
所谓的洗脱体积是指从洗脱开始
到某蛋白质出现达到浓度最高
值时所用的洗脱液的体积
离子交换层析在蛋白质
分离纯化过程中
常常是在精细分离时使用
请看下面的案例
这是鸡卵粘蛋白分离纯化
过程中的一个步骤
该蛋白前期通过丙酮沉淀 粗分离
再进行细分级分离时
采用了离子交换层析技术
填料是阴离子交换纤维素DEAE
图中三是鸡卵粘蛋白的洗脱峰
以上是本视频的主要内容
下面我将对本视频进行小结
在本视频中我首先介绍了
离子交换层析技术的原理
和离子交换剂种类
之后介绍了离子交换层析的洗脱方式
下一个视频将向大家
介绍亲和层析技术
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试




