当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 蛋白质分离的一般原则和基本步骤
当你研究某一蛋白质的结构与功能时,你首先需要将其从生物材料中的众多生物分子中分离出来,并达到一定的纯度。习惯上将被分离的蛋白质称为目标蛋白,其他成分称为杂质。
第一:确定目标蛋白的检测方法:在对蛋白质进行分离纯化以前,首先需要决定使用什么方法对所需的样品进行检测,也就是说应该能“看到”或者“识别”要分离的目标蛋白。你可以检测目标蛋白的分子量、也可以检测目标蛋白的特征吸收光谱、当然最重要的是通过活性检测,以区分目标蛋白与杂蛋白。
2. 选择合适的材料和分离方法
假如,摆在你面前有两种材料,都含有你想获得的目标蛋白。那你如何选择呢?
对了,应该选择目标蛋白含量高的材料,便宜和容易获得的材料;
多数蛋白质分离纯化都不可能一步完成,很多都需要经过多次分离才能达到纯化的目的。在选择方法时,应该尽可能选用不同原理的分离方法,并加以组合;或者即使是使用类似的方法,但也需要改变分离条件。
3. 在注重提高蛋白质纯度的同时,应该也考虑提高蛋白质的产量,并尽可能保持蛋白质的活性。为了避免蛋白质变性或降解,整个分离纯化过程一般要求在低温条件下进行。
分离纯化蛋白质通常需要经历前处理、粗分离、精细分离、蛋白质鉴定等过程
让我们先来看看前处理过程吧
这个过程是指通过破碎组织,将预分离的蛋白质释放到提取缓冲液中,如果目标蛋白是胞内蛋白,那还需要破碎细胞。
在进行蛋白质分离纯化时,通常以磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液,等等作为提取液,它们都具有一定的缓冲能力,可以避免在提取过程中由于提取液pH值发生较大幅度的变化而导致目标蛋白活性丧失的事件发生。同样,蛋白质提取缓冲液中也会加入保护蛋白质巯基的还原剂、抑制蛋白酶的抑制剂等等;如果目标蛋白是膜蛋白,还需要加入TritonX-100等表面活性剂,溶解细胞膜,使膜蛋白进入提取液。
当用蛋白质提取缓冲液提取蛋白质一定时间后,可将提取液转入离心管,离心,收集上清液,弃去细胞或者组织残渣。如此,可获得含有目标蛋白的粗提液。不过,该提取液还含有大量的杂蛋白。
经过离心去除细胞残渣的上清液中蛋白质种类很多。此阶段,通常采用一些能够使目标蛋白质和大多数杂蛋白分开的方法进行目标蛋白的分离,这也就是所谓的粗分级分离(Rough fractionation),或者称为粗分离。常用的方法有盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、超滤等等。
经过粗分级分离后,含有目标蛋白的混合物样品中杂蛋白已经相对比较少了,此时选择其他方法对样品进行进一步的提纯,这个过程被称为精细分级分离(Fine fractionation)。在这个阶段常常选用的方法有亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析以及制备电泳等技术。
经过很多步骤纯化后,你终于获得了目标蛋白,此时需要做的工作是对目标蛋白进行鉴定。
以上就是蛋白质分离纯化所经历的几个步骤。
那么蛋白质分离纯化有哪些技术呢?
请看这张图。常见的蛋白质分离纯化技术如图所示,可以依据蛋白质的溶解度、带电荷性质、以及蛋白质与其他分子的结合特性、蛋白质分子大小等进行分类。在每一个分类依据下,蛋白质分离纯化技术还包括多种形式。例如:依据蛋白质溶解度的分离纯化技术又包括盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等。
下一个视频我将逐一介绍蛋白质分离纯化的各项技术。
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-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
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-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
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-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
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--盐析操作注意事项
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--离子交换层析
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--亲和层析
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--IMAC亲和层析
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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试