当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第二节 核酸的提取和检测 > 紫外分光光度法测定核酸
核酸包括核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)两类,它们分别是由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸以3¢,5¢-磷酸二酯键相连形成的生物大分子。
核苷酸是由核苷加磷酸组成,而核苷由碱基和戊糖组成。
由于碱基中嘧啶、嘌呤以及核苷和核苷酸都具有共轭双键系统,致使它们在240~290 nm的紫外区有强烈的光吸收,最高吸收峰出现在260 nm,所以研究人员利用紫外检测仪,在260 nm波长下测定核酸的光吸收值A260,从而确定核酸的含量。
核酸紫外分光光度法测定操作与之前蛋白质含量的紫外分光光度法测定相似,只是波长不同。
通常认为A260为1时,相当于双螺旋DNA 的浓度是50 μg/mL、单链寡核苷酸浓度是33 μg/mL、单链RNA 浓度是40 μg/mL。那下面你试着计算一下样品中核酸的含量吧?
假如这里有一个双链DNA的样品,其A260为0.8,那么该样品中DNA的浓度是多少呢?如果样品是单链RNA呢?
对,样品中DNA浓度是 40 μg/mL、如果是单链RNA的话,其浓度是32 μg/mL。
紫外分光光度法不仅能够检测核酸的含量,还可以判断核酸的纯度。
记得前面讲DNA制备吧,常常会发生制备的DNA中有其他杂质,比如蛋白质、RNA等。蛋白质不仅在紫外280nm有最大光吸收,而且在260nm也有一定的吸收,而RNA最大光吸收也在260nm。研究人员常常以测定的A260与A280的比值来确定核酸的纯度。一般认为纯品RNA 该比值接近2.0,如果比值小于2.0,表明样品中有明显的蛋白质的污染;而纯品DNA 该比值接近1.8, 当比值大于1.8时,可能样品中有RNA的污染,如果小于1.8,可能有蛋白质的污染。此外, A260与A230的比值也常常用于核酸纯度的判定。纯 DNA或者RNA的A260与A230的比值保持在1.8 ~ 2.2。若比值小于1.8表明样品被糖类、盐类或有机溶剂污染,样品需要纯化。
由于常规分光光度计所使用的比色杯体积比较大,很难对体积小、浓度低的核酸样品进行测定,因此,目前微量分光光度计成为实验室普遍使用的核酸测定仪器。常见的微量分光光度计有很多种,这里以ThermoScientific公司生产的NanoDrop分光光度计为例,介绍核酸的微量测定。
Nano Drop是全波长的分光光度计,波长范围是220~750 nm,可以检测的最小样品体积是1 ul。如图片所示,这是基座,是样品放置的部位,这是取样臂。
打开取样臂,吸取待测样品,将其置放在下部测量基座的表面。关闭取样臂。
此时样品液滴会自动在上下测量的基座之间形成液柱,如此就可以测量了。
之后,需要使用计算机上的操作软件进行测量和数据获取。这就是计算机的测量结果界面,上面出现了测量数据,比如有样品的浓度654.9 ng/µL,A260与A280,A260与A230的两个比值,恰好都是1.98。
测量结束后,打开取样臂,使用比较柔软的纸,擦去上下测量基座表面上的样品溶液即可。
下面提一个问题,如果刚才的测试样品是DNA,依据获得的数据,试分析DNA样品纯度。请思考一下吧。考虑 A260与A280的比值,纯品DNA 该值接近1.8,而测量数据是1.98,说明样品中可能有RNA的污染。纯 DNA样品A260与A230的比值为 1.8 – 2.2。这里测量值是1.98,表明样品没有糖类、盐类或有机溶剂的污染。
通过这部分内容的学习,大家了解了紫外分光光度法测定核酸的过程,明确了该方法不仅能够测定核酸的含量,还可以通过获得的A260与A280和A260与A230两个比值判断核酸的纯度。
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