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当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第五章 物质的分离纯化 >  第二节 核酸的提取和检测 >  紫外分光光度法测定核酸

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紫外分光光度法测定核酸

核酸包括核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)两类,它们分别是由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸以3¢,5¢-磷酸二酯键相连形成的生物大分子。

核苷酸是由核苷加磷酸组成,而核苷由碱基和戊糖组成。

由于碱基中嘧啶、嘌呤以及核苷和核苷酸都具有共轭双键系统,致使它们在240~290 nm的紫外区有强烈的光吸收,最高吸收峰出现在260 nm,所以研究人员利用紫外检测仪,在260 nm波长下测定核酸的光吸收值A260,从而确定核酸的含量。

核酸紫外分光光度法测定操作与之前蛋白质含量的紫外分光光度法测定相似,只是波长不同。

通常认为A260为1时,相当于双螺旋DNA 的浓度是50 μg/mL、单链寡核苷酸浓度是33 μg/mL、单链RNA 浓度是40 μg/mL。那下面你试着计算一下样品中核酸的含量吧?

假如这里有一个双链DNA的样品,其A260为0.8,那么该样品中DNA的浓度是多少呢?如果样品是单链RNA呢?

对,样品中DNA浓度是 40 μg/mL、如果是单链RNA的话,其浓度是32 μg/mL。

 

紫外分光光度法不仅能够检测核酸的含量,还可以判断核酸的纯度。

记得前面讲DNA制备吧,常常会发生制备的DNA中有其他杂质,比如蛋白质、RNA等。蛋白质不仅在紫外280nm有最大光吸收,而且在260nm也有一定的吸收,而RNA最大光吸收也在260nm。研究人员常常以测定的A260与A280的比值来确定核酸的纯度。一般认为纯品RNA 该比值接近2.0,如果比值小于2.0,表明样品中有明显的蛋白质的污染;而纯品DNA 该比值接近1.8, 当比值大于1.8时,可能样品中有RNA的污染,如果小于1.8,可能有蛋白质的污染。此外, A260与A230的比值也常常用于核酸纯度的判定。纯 DNA或者RNA的A260与A230的比值保持在1.8 ~ 2.2。若比值小于1.8表明样品被糖类、盐类或有机溶剂污染,样品需要纯化。

由于常规分光光度计所使用的比色杯体积比较大,很难对体积小、浓度低的核酸样品进行测定,因此,目前微量分光光度计成为实验室普遍使用的核酸测定仪器。常见的微量分光光度计有很多种,这里以ThermoScientific公司生产的NanoDrop分光光度计为例,介绍核酸的微量测定。

Nano Drop是全波长的分光光度计,波长范围是220~750 nm,可以检测的最小样品体积是1 ul。如图片所示,这是基座,是样品放置的部位,这是取样臂。

打开取样臂,吸取待测样品,将其置放在下部测量基座的表面。关闭取样臂。

此时样品液滴会自动在上下测量的基座之间形成液柱,如此就可以测量了。

之后,需要使用计算机上的操作软件进行测量和数据获取。这就是计算机的测量结果界面,上面出现了测量数据,比如有样品的浓度654.9 ng/µL,A260与A280,A260与A230的两个比值,恰好都是1.98。

测量结束后,打开取样臂,使用比较柔软的纸,擦去上下测量基座表面上的样品溶液即可。

下面提一个问题,如果刚才的测试样品是DNA,依据获得的数据,试分析DNA样品纯度。请思考一下吧。考虑 A260与A280的比值,纯品DNA 该值接近1.8,而测量数据是1.98,说明样品中可能有RNA的污染。纯 DNA样品A260与A230的比值为 1.8 – 2.2。这里测量值是1.98,表明样品没有糖类、盐类或有机溶剂的污染。

通过这部分内容的学习,大家了解了紫外分光光度法测定核酸的过程,明确了该方法不仅能够测定核酸的含量,还可以通过获得的A260与A280和A260与A230两个比值判断核酸的纯度。  


下一节:你想得到什么分子,如何纯化呢?

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基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

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-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

紫外分光光度法测定核酸笔记与讨论

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