当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第二章 生命科学三大必备仪器的使用 > 第五节 分光光度法测定待测物浓度 > 分光光度法测定物质浓度的实验设计
我们在前面的
学习中
已经学习了分光光度法
测定物质浓度的原理
今天我们一起来思考
当你要设计一个分光
光度法测定物质浓度的实验时
你的思路是什么
需要注意什么
对于本身就具有光吸收的物质来说
相对比较简单
我们主要需要考虑的是以下三个方面
首先选择什么波长来进行测定
我们知道
每一种物质在光谱不同的波段
它的吸光度不同
比如我们前面讲
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸
在紫外区有光吸收
通过这张吸收光谱图我们可以看出来
在250纳米到300
纳米的紫外光区中
两种氨基酸在280纳米
附近的吸光度最强
所以我们一般就把蛋白质的定量
测定波长定在280纳米
这就是我们设计分光光度
法实验的第一个原则
一般选用物质光吸收最
强的波长进行测定
确定了波长后
我们还要确定待测物的浓度范围
也就是标准曲线和待测样品
的浓度大致在什么范围
这个范围选择的原则
一般是
标准曲线吸光度分布在
0.2~0.8的范围内
也可以拓展到0.2~1的范围
但必须要保证标准曲线
各样品的吸光度和浓度成正比
在此范围内设计方便加样的体积即可
而待测浓度样品要通过预实验
初步确定大致的浓度
测定前将其稀释到吸光度
值落在标准曲线的中段
因为根据理论推导计算
分光光度法测定误差最小的点
为吸光度值在0.434
透光率为36.8%
这个点
误差最小
所以应尽量让待测物的吸光度
值在此周围减小相对误差
比如说这
是一位同学做的紫外法
测定蛋白质浓度的标准曲线
加量体积标准曲线浓度和吸光度值
除了以上两点
第三项要考虑的问题是对照管的设计
我们学习分光光度计用法的时候
已经知道测定样品浓度前
需要将比色杯反射
折射和溶剂的影响去除掉
这只用于去除非待测物影响的样品
我们一般称之为空白管
将其设计为标准曲线的第一管
在实际的测定操作中
用于调节透光率100%
对于本身就有光吸收的
物质空白管的设计
一般只需
要用
溶解待测物的溶剂即可
比如说我们
前面讲过蛋白质的测定
实验中标准蛋白质溶液是水溶液
溶剂只有水
所以用做空白管来扣除
影响的就是纯水
前面我们也学过很多物质本身
实际上并不具有光吸收
或者需要与试剂反应来增强吸光度
提高灵敏度
这些通过发生化学反应
生成有色物质来进行测定的
实验设计有什么不同吗
首先波长的选择
一般也是选择所生成的有光吸收
物质的最大光吸收波长
不过有时候我们也需要考虑残余
的反应试剂带来的影响
如果反应试剂和产物的吸光度有重叠
则要考虑选择反应试剂影响
比较小而产物光吸收又
比较强的波长来进行测定
而不一定是产物的最大光吸收波长
比如说这幅图中
反应物和产物
在产物吸光度最强的波长1这个位置
反应物也有一定的光吸收
会对最后的测定和计算造成误差
在这种情况下就应该选择
波长2进行产物的测定
尽可能排除反应物对吸光度的影响
其次关于吸光度范围的
选择原则是一致的
尽量让吸光度落在
0.2~0.8的范围内
需要注意的是
有些物质与反应物发生
反应受到条件的限制
线性范围比较窄
此时就要选择产物与待测物
浓度呈线性的吸光度范围
设计实验
而不一定非要达到0.8
此外还有一些产物的生成
需要一定的时间过程
或者所生成的产物只在一定
的时间内稳定存在
这个时候就要在操作中
严格控制操作时间
第三是对照管的设计
对于需要发生反应才能生成
有色物质的实验来说
对照管的设计
除了要扣除
溶剂的影响以外
还要扣除反应物的影响
所以对照管中除了溶剂
还需要与其他测定管
等量等比例的加入
所有的反应试剂
也就是说
除了你的待测物不加以外
其他的试剂都要按比例等量加入
而且保证和其它样品管
的反应条件完全一致
用这样的空白管调节仪器
透光率100%就可以一次性扣除
掉所有试剂带来的影响
比如我们用
双缩脲试剂测定蛋白质浓度的实验中
标准曲线是这样设计的
用
第一管作为空白管调透光率100%
就可以扣除掉比色杯溶剂和
双缩脲试剂等所有影响
此外
有些特殊情况下
如果反应体系中有些物质
的光吸收比较强
会影响测定
还可以加入一定的掩蔽剂
让待测物之外的干扰物发生络合反应
使其颜色不会影响到测定
但是要注意
所有样品中加入的试剂必须保持一致
还有一点要说明的是
分光光度法的测定只适用于均匀溶液
对于浑浊溶液来说
入射光会因散射损失导致吸光度增强
标准曲线偏离线性
所以务必要保证测定体系为均匀
的溶液
以上就是大家在设计分光光度法
测定物质浓度的实验中
需要考虑的几方面因素和注意事项
实际工作中可能还需要根据反应
的原理和特点进行调整
如果你在实践中遇到了问题
欢迎在论坛跟大家一起讨论
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