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BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

BCA,即二喹啉甲酸,又称双金鸡宁酸或双辛丹宁酸,1985年Pierce [pɪrs] 公司的Paul K. Smith研究发现BCA可与蛋白质和铜离子的络合物发生反应生成有颜色的物质,从而建立了BCA法测定蛋白质浓度,所以此方法又被称为史密斯法,这也是目前实验室很常用的蛋白定量方法之一。

这种方法的反应原理是:碱性条件下蛋白中的还原性氨基酸,主要是半胱氨酸,酪氨酸和色氨酸残基会与溶液中的二价铜离子发生反应,将二价铜离子还原成一价铜离子。生成的一价铜离子与溶液中的BCA发生络合反应,每两分子的BCA可以与一个一价铜离子络合,生成紫色的络合物。所生成的紫色物质在562 nm的吸光度值与溶液中还原性氨基酸残基的浓度成正比,我们可以近似的看做紫色物质的吸光度与溶液中蛋白质的浓度成正比,由此可以利用分光光度法计算出溶液中蛋白的浓度。

BCA反应试剂的pH值为11.25的时候产物吸光度最强,因此BCA反应试剂的配制过程中,需要调节pH值到11.25,否则将影响显色和测定灵敏度。

BCA试剂分为A液和B液分别配制,BCA试剂A液中含有:BCA钠盐,碳酸钠,酒石酸钠,NaOH,碳酸氢钠;BCA试剂B液为4%硫酸铜溶液,A液和B液分别可以在室温下稳定保存1年
BCA工作试剂由A液和B液按照50:1的比例配制,此工作液当天有效,应在使用当天根据需要的量新鲜配制。

BCA法可测定蛋白浓度的线性范围在10到1000ug/mL之间。测定时蛋白溶液与BCA工作试剂的比例为1:20,比如所测定的蛋白溶液为0.1ml的话,需要加入2ml BCA试剂。因为此反应需要蛋白中所含半胱氨酸,酪氨酸和色氨酸残基还原二价铜离子,所以不同种的蛋白质所含氨基酸种类和比例对反应产物的吸光度有一定影响,比如图中所示不同的蛋白质与BCA试剂发生反应后生成的产物吸光度值有所差异。
你看,明胶与BCA发生反应生成的显色产物显著少于其他蛋白质,思考一下这是为什么呢?

BCA法所用样品液和工作液的体积也可以根据实际情况适当改变。根据测定设备设计测定体积,前提是要保证标准品的浓度,并将吸光度值控制在1.0以下。

此方法建立后,有人对配方进一步改进,建立了BCA微量测定方法,提高测定的灵敏度。

微量BCA试剂分为A液、B液和C液,A液中含有:碳酸钠,酒石酸钠,pH11.25,B液中含有:BCA钠盐,C液为4%硫酸铜溶液,A液、B液和C液分别可以在室温下稳定保存1年,BCA工作试剂由A液、B液和C液按照25:25:1的比例配制,此工作液当天有效,使用时,蛋白质和BCA试剂等比例加入,微量BCA测定体系测定的蛋白质浓度范围为0.5-40ug/ml。

BCA与蛋白质的反应在室温、37℃、60℃均可发生,60℃时反应速度快于37℃和室温,因此相同时间中在60℃比在37℃反应生成的产物量多,所以60℃更适合测定蛋白浓度较低的样品。

下面,我们就利用BCA法来测定一个未知蛋白质溶液的浓度,本次实验我们采用大量测定的BCA试剂和37℃反应条件。

首先制作标准曲线,我们计划使用722N型分光光度计和1cm光径比色皿,此比色皿最小测定体积约3ml,因此我们设计使用4ml反应体系,按照蛋白溶液与BCA工作试剂比例为1:20的比例,加入蛋白质溶液总体积0.2ml,且蛋白质浓度在0-1mg/ml之间,我们利用水和1mg/ml的蛋白质标准液配制出一系列浓度梯度的标准曲线溶液,同时在样品管中各加入未知样品0.2ml,至少做3个重复样。

在标准曲线和样品管中依次加入新鲜配制的BCA试剂4ml,混匀,标准曲线和样品一起放入37℃水浴锅,请注意保证标准曲线和未知样品的反应同步性,一起加试剂,一起加热,反应结束后一起冷却。

反应结束后,利用722N可见分光光度计对产物的吸光度进行测定,调节波长为562nm,首先调透光率为0%,再以标准曲线第一管为空白管,调节透光率为100%,转换到吸光度测定档,检查空白管吸光度为0,拉动拉杆,依次测定各管吸光度。

每次记录完光吸收值,需要先调回透光率档位,再打开样品池盖取出样品更换。重复使用的比色皿请注意清洗和润洗,详细操作见《722N分光光度计的设计原理和使用规范》的课程。

平行样应尽量同步测定,以减少误差。平行样的吸光度值先取平均值再计算浓度。

以蛋白质浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,做标准曲线,通过线上取点或公式计算的方式利用未知样品的吸光度计算其浓度。

BCA法与Folin酚法灵敏度相似,操作比Folin酚法简便,而且BCA试剂稳定,操作过程中对时间和振荡等操作控制不像Folin酚法那么严格,此外,其最大优点是抗试剂干扰能力强,蛋白质提取中常用的低浓度Tris、Triton 100、尿素、盐酸胍等均对BCA法没有影响。

请注意,虽然刺激性和腐蚀性不如Folin酚试剂强,但BCA对皮肤和眼睛还是有一定刺激性,请小心操作避免沾染,不小心沾染后请立即清洗或就医。

 


下一节:BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

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-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法笔记与讨论

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