当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法
BCA,即二喹啉甲酸,又称双金鸡宁酸或双辛丹宁酸,1985年Pierce [pɪrs] 公司的Paul K. Smith研究发现BCA可与蛋白质和铜离子的络合物发生反应生成有颜色的物质,从而建立了BCA法测定蛋白质浓度,所以此方法又被称为史密斯法,这也是目前实验室很常用的蛋白定量方法之一。
这种方法的反应原理是:碱性条件下蛋白中的还原性氨基酸,主要是半胱氨酸,酪氨酸和色氨酸残基会与溶液中的二价铜离子发生反应,将二价铜离子还原成一价铜离子。生成的一价铜离子与溶液中的BCA发生络合反应,每两分子的BCA可以与一个一价铜离子络合,生成紫色的络合物。所生成的紫色物质在562 nm的吸光度值与溶液中还原性氨基酸残基的浓度成正比,我们可以近似的看做紫色物质的吸光度与溶液中蛋白质的浓度成正比,由此可以利用分光光度法计算出溶液中蛋白的浓度。
BCA反应试剂的pH值为11.25的时候产物吸光度最强,因此BCA反应试剂的配制过程中,需要调节pH值到11.25,否则将影响显色和测定灵敏度。
BCA试剂分为A液和B液分别配制,BCA试剂A液中含有:BCA钠盐,碳酸钠,酒石酸钠,NaOH,碳酸氢钠;BCA试剂B液为4%硫酸铜溶液,A液和B液分别可以在室温下稳定保存1年
BCA工作试剂由A液和B液按照50:1的比例配制,此工作液当天有效,应在使用当天根据需要的量新鲜配制。
BCA法可测定蛋白浓度的线性范围在10到1000ug/mL之间。测定时蛋白溶液与BCA工作试剂的比例为1:20,比如所测定的蛋白溶液为0.1ml的话,需要加入2ml BCA试剂。因为此反应需要蛋白中所含半胱氨酸,酪氨酸和色氨酸残基还原二价铜离子,所以不同种的蛋白质所含氨基酸种类和比例对反应产物的吸光度有一定影响,比如图中所示不同的蛋白质与BCA试剂发生反应后生成的产物吸光度值有所差异。
你看,明胶与BCA发生反应生成的显色产物显著少于其他蛋白质,思考一下这是为什么呢?
BCA法所用样品液和工作液的体积也可以根据实际情况适当改变。根据测定设备设计测定体积,前提是要保证标准品的浓度,并将吸光度值控制在1.0以下。
此方法建立后,有人对配方进一步改进,建立了BCA微量测定方法,提高测定的灵敏度。
微量BCA试剂分为A液、B液和C液,A液中含有:碳酸钠,酒石酸钠,pH11.25,B液中含有:BCA钠盐,C液为4%硫酸铜溶液,A液、B液和C液分别可以在室温下稳定保存1年,BCA工作试剂由A液、B液和C液按照25:25:1的比例配制,此工作液当天有效,使用时,蛋白质和BCA试剂等比例加入,微量BCA测定体系测定的蛋白质浓度范围为0.5-40ug/ml。
BCA与蛋白质的反应在室温、37℃、60℃均可发生,60℃时反应速度快于37℃和室温,因此相同时间中在60℃比在37℃反应生成的产物量多,所以60℃更适合测定蛋白浓度较低的样品。
下面,我们就利用BCA法来测定一个未知蛋白质溶液的浓度,本次实验我们采用大量测定的BCA试剂和37℃反应条件。
首先制作标准曲线,我们计划使用722N型分光光度计和1cm光径比色皿,此比色皿最小测定体积约3ml,因此我们设计使用4ml反应体系,按照蛋白溶液与BCA工作试剂比例为1:20的比例,加入蛋白质溶液总体积0.2ml,且蛋白质浓度在0-1mg/ml之间,我们利用水和1mg/ml的蛋白质标准液配制出一系列浓度梯度的标准曲线溶液,同时在样品管中各加入未知样品0.2ml,至少做3个重复样。
在标准曲线和样品管中依次加入新鲜配制的BCA试剂4ml,混匀,标准曲线和样品一起放入37℃水浴锅,请注意保证标准曲线和未知样品的反应同步性,一起加试剂,一起加热,反应结束后一起冷却。
反应结束后,利用722N可见分光光度计对产物的吸光度进行测定,调节波长为562nm,首先调透光率为0%,再以标准曲线第一管为空白管,调节透光率为100%,转换到吸光度测定档,检查空白管吸光度为0,拉动拉杆,依次测定各管吸光度。
每次记录完光吸收值,需要先调回透光率档位,再打开样品池盖取出样品更换。重复使用的比色皿请注意清洗和润洗,详细操作见《722N分光光度计的设计原理和使用规范》的课程。
平行样应尽量同步测定,以减少误差。平行样的吸光度值先取平均值再计算浓度。
以蛋白质浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,做标准曲线,通过线上取点或公式计算的方式利用未知样品的吸光度计算其浓度。
BCA法与Folin酚法灵敏度相似,操作比Folin酚法简便,而且BCA试剂稳定,操作过程中对时间和振荡等操作控制不像Folin酚法那么严格,此外,其最大优点是抗试剂干扰能力强,蛋白质提取中常用的低浓度Tris、Triton 100、尿素、盐酸胍等均对BCA法没有影响。
请注意,虽然刺激性和腐蚀性不如Folin酚试剂强,但BCA对皮肤和眼睛还是有一定刺激性,请小心操作避免沾染,不小心沾染后请立即清洗或就医。
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-第三章 物质的定量测定 作业
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