当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > IMAC亲和层析
同学们大家好
今天我要向大家介绍
亲和层析的另外一种技术
固定化
金属离子亲和层析
Immobilized Metal
Ion Affinity
Chromatography
取每个单词的字头简称为IMAC
这项技术和我之前谈到的亲和
层析技术有什么不同呢?
现在就让我和你一起进行
IMAC技术的学习
IMAC技术是依据待分离物质
与金属离子之间的结合特性
如图所示
假如蓝色的图形表示的是金属离子
灰色的不规则图形表示的是蛋白质
要特别注意
这种蛋白质表面需要
有一定量的组氨酸
组氨酸侧链的咪唑基
如图红色标注的部分所示
能够和金属离子紧密结合
形成络合物
这就是IMAC技术所利用的
物质之间的特异结合性质
换句话说就是蛋白质
因为有组氨酸才可以和
金属离子特异结合
如何利用这种特异结合
进行物质的分离
纯化呢?
图1显示的是IMAC层析柱
用该柱进行蛋白质分离纯化的关键
自然是层析柱中的吸附介质
也叫层析柱介质
在图2中黄色的长方形表示凝胶载体
绿色长方形代表的是
亚氨基二乙酰乙酸钠
是柱载体凝胶的配基
蓝色圆球代表了金属离子
可以看出配基亚氨基二乙酰乙酸钠
能够作为桥梁连接载体
并鳌合二价金属离子
三者最终形成了IMAC
亲和层析柱的吸附介质
准备好了IMAC亲和柱的吸附介质
那么现在我们就可以分离
想要的目标物质了
如图所示
假如样品混合物中有三种蛋白质
AB和C
我要的目标蛋白是C
这里显示杂蛋白
A和B由于不能和亲和柱吸附
介质结合而穿柱流出
只有C蛋白能够与吸附介质
上的金属离子结合
形成络合物结合在柱上
如此目标蛋白就和杂蛋白分开了
这就是所谓的固定化金属离子亲和
层析
IMAC技术
前面提到蛋白质和金属离子结合
依据的是蛋白质表面
的组氨酸残基侧链
咪唑基
其实蛋白质表面的其他氨基酸残基
例如色氨酸
半胱氨酸
侧链基团也可以与过渡金属离子
铜离子
锌离子
镍离子和铁离子形成复合物
只是它们的结合能力也远远小于
组氨酸残基与金属离子的结合
IMAC技术既然依据的是蛋白质
与金属离子的结合特性
那么结合能力的强弱就自然成为影响
蛋白质分离效果的关键因素
所以为了提高纯化效率
在实际操作中常常是为
待纯化的目标蛋白
加上多个组氨酸
以增强蛋白质与金属离子的结合
如图所示习惯上
研究人员会加6个以上连续的组氨酸
到目标蛋白质的N端或者C端
形成融合蛋白
由这些组氨酸残基的
咪唑基与柱凝胶介质上螯合
的金属离子紧密结合
以达到分离纯化蛋白的目的
当纯化带有多聚组氨酸
标签的融合蛋白质时
首先选择的是镍离子
你可能有疑惑了
难道没有组氨酸标签的蛋白就无法
用该项技术分离纯化了吗
也不完全是
有些蛋白质虽然没有标签
但是也可以和金属离子特异结合
这种情况当然可以用IMAC技术了
只是选择的金属离子
依据其于目标蛋白的结合
特性不同而有所差异
有的蛋白质特意结合铜离子
具体操作时就选择铜离子
当分离纯化的蛋白质是未知蛋白时
首先选择铜离子
因为铜离子能够结合很多种的蛋白质
其实实验室目前常用的IMAC
技术普遍适用于分离纯化
带有多聚组氨酸标签的蛋白质
如何利用IMAC技术分离纯化
带有多聚组氨酸标签的融合蛋白
在你脑海中可能会出现一个问号
什么是带有多聚组氨酸
标签的融合蛋白呢?
如何获得它呢
解决这个问题还需要
分子生物学的知识
在这里让我简化说明一下
假如你可以获得一段编码
多聚组氨酸和编码目标
蛋白的DNA序列
你把这段序列插入到一个细菌质粒中
质粒就是细菌基因组DNA
之外的环形DNA分子
它可以随着细菌的生长进行复制
转录和翻译
如此插在质粒上的编码融合蛋白
的序列就被转录和翻译出来
在细菌细胞中就有了你想要的带有
多聚组氨酸标签的融合蛋白了
请看这张图
图中最左边的上面圆圈是带有
融合蛋白DNA序列的质粒
当你将质粒转入大肠杆菌中融合蛋白
就能够在细菌细胞中被翻译出来
裂解大肠杆菌细胞裂解液中就含有
丰富的多聚组氨酸标签的
融合蛋白
将裂解液加到Ni柱上
用清洗缓冲液清洗未与亲和柱
结合的其他蛋白
之后再用含有高浓度咪唑的洗脱液
洗脱目标蛋白
如此你就获得了想要的目标蛋白了
以上就是本视频的主要内容
在这个视频中我首先讲解
了IMAC的原理
随后简单介绍了利用IMAC纯化
带有多聚组氨酸标签融合蛋白的过程
在下一个视频中
我将简要介绍IMAC
技术的基本步骤
欢迎同学们继续和我一起学习
谢谢大家
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试