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IMAC亲和层析在线视频

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IMAC亲和层析课程教案、知识点、字幕

同学们大家好

今天我要向大家介绍

亲和层析的另外一种技术

固定化

金属离子亲和层析

Immobilized Metal 

Ion Affinity

 Chromatography

取每个单词的字头简称为IMAC

这项技术和我之前谈到的亲和

层析技术有什么不同呢?

现在就让我和你一起进行

IMAC技术的学习

IMAC技术是依据待分离物质

与金属离子之间的结合特性

如图所示

假如蓝色的图形表示的是金属离子

灰色的不规则图形表示的是蛋白质

要特别注意

这种蛋白质表面需要

有一定量的组氨酸

组氨酸侧链的咪唑基

如图红色标注的部分所示

能够和金属离子紧密结合

形成络合物

这就是IMAC技术所利用的

物质之间的特异结合性质

换句话说就是蛋白质

因为有组氨酸才可以和

金属离子特异结合

如何利用这种特异结合

进行物质的分离

纯化呢?

图1显示的是IMAC层析柱

用该柱进行蛋白质分离纯化的关键

自然是层析柱中的吸附介质

也叫层析柱介质

在图2中黄色的长方形表示凝胶载体

绿色长方形代表的是

亚氨基二乙酰乙酸钠

是柱载体凝胶的配基

蓝色圆球代表了金属离子

可以看出配基亚氨基二乙酰乙酸钠

能够作为桥梁连接载体

并鳌合二价金属离子

三者最终形成了IMAC

亲和层析柱的吸附介质

准备好了IMAC亲和柱的吸附介质

那么现在我们就可以分离

想要的目标物质了

如图所示

假如样品混合物中有三种蛋白质

AB和C

我要的目标蛋白是C

这里显示杂蛋白

A和B由于不能和亲和柱吸附

介质结合而穿柱流出

只有C蛋白能够与吸附介质

上的金属离子结合

形成络合物结合在柱上

如此目标蛋白就和杂蛋白分开了

这就是所谓的固定化金属离子亲和

层析

IMAC技术

前面提到蛋白质和金属离子结合

依据的是蛋白质表面

的组氨酸残基侧链

咪唑基

其实蛋白质表面的其他氨基酸残基

例如色氨酸

半胱氨酸

侧链基团也可以与过渡金属离子

铜离子

锌离子

镍离子和铁离子形成复合物

只是它们的结合能力也远远小于

组氨酸残基与金属离子的结合

IMAC技术既然依据的是蛋白质

与金属离子的结合特性

那么结合能力的强弱就自然成为影响

蛋白质分离效果的关键因素

所以为了提高纯化效率

在实际操作中常常是为

待纯化的目标蛋白

加上多个组氨酸

以增强蛋白质与金属离子的结合

如图所示习惯上

研究人员会加6个以上连续的组氨酸

到目标蛋白质的N端或者C端

形成融合蛋白

由这些组氨酸残基的

咪唑基与柱凝胶介质上螯合

的金属离子紧密结合

以达到分离纯化蛋白的目的

当纯化带有多聚组氨酸

标签的融合蛋白质时

首先选择的是镍离子

你可能有疑惑了

难道没有组氨酸标签的蛋白就无法

用该项技术分离纯化了吗

也不完全是

有些蛋白质虽然没有标签

但是也可以和金属离子特异结合

这种情况当然可以用IMAC技术了

只是选择的金属离子

依据其于目标蛋白的结合

特性不同而有所差异

有的蛋白质特意结合铜离子

具体操作时就选择铜离子

当分离纯化的蛋白质是未知蛋白时

首先选择铜离子

因为铜离子能够结合很多种的蛋白质

其实实验室目前常用的IMAC

技术普遍适用于分离纯化

带有多聚组氨酸标签的蛋白质

如何利用IMAC技术分离纯化

带有多聚组氨酸标签的融合蛋白

在你脑海中可能会出现一个问号

什么是带有多聚组氨酸

标签的融合蛋白呢?

如何获得它呢

解决这个问题还需要

分子生物学的知识

在这里让我简化说明一下

假如你可以获得一段编码

多聚组氨酸和编码目标

蛋白的DNA序列

你把这段序列插入到一个细菌质粒中

质粒就是细菌基因组DNA

之外的环形DNA分子

它可以随着细菌的生长进行复制

转录和翻译

如此插在质粒上的编码融合蛋白

的序列就被转录和翻译出来

在细菌细胞中就有了你想要的带有

多聚组氨酸标签的融合蛋白了

请看这张图

图中最左边的上面圆圈是带有

融合蛋白DNA序列的质粒

当你将质粒转入大肠杆菌中融合蛋白

就能够在细菌细胞中被翻译出来

裂解大肠杆菌细胞裂解液中就含有

丰富的多聚组氨酸标签的

融合蛋白

将裂解液加到Ni柱上

用清洗缓冲液清洗未与亲和柱

结合的其他蛋白

之后再用含有高浓度咪唑的洗脱液

洗脱目标蛋白

如此你就获得了想要的目标蛋白了

以上就是本视频的主要内容

在这个视频中我首先讲解

了IMAC的原理

随后简单介绍了利用IMAC纯化

带有多聚组氨酸标签融合蛋白的过程

在下一个视频中

我将简要介绍IMAC

技术的基本步骤

欢迎同学们继续和我一起学习

谢谢大家

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

IMAC亲和层析笔记与讨论

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