当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 > 利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量
同学们,我们已经学习了实验室常用的SDS-PAGE电泳的原理以及操作,SDS-PAGE电泳在实验室应用非常广泛,其中一个主要的应用就是测定蛋白质的分子质量。SDS-PAGE测定蛋白质分子质量的原理是什么呢?具体又是怎样操作的呢?这节课我们就来学习SDS-PAGE测定蛋白质分子质量的方法。
用SDS-PAGE测定蛋白质分子质量时,蛋白质样品需要经过样品裂解液的处理,样品裂解液中含有SDS和还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇,也就是我们所说的DTT,处理后的蛋白质解离为单肽链,成为带有大量负电荷、长椭圆棒状的SDS-蛋白质复合物,在电场中迁移率不受原有电荷和形状的影响,只与椭圆棒的长度,即蛋白质分子质量有关。
电泳过程中,蛋白质根据分子量进行分离,通过染色,我们可以看到一条条的蛋白质条带,那怎样根据图片分析某个未知蛋白质的分子质量呢?
1969年,研究者对37种蛋白质分子质量与迁移率之间的关系进行了研究,实验证实当蛋白质相对分子质量在15-200 kD的范围内,电泳迁移率与分子质量的对数呈线性关系。蛋白质条带的迁移率是可以从电泳图片上测量得到的,再根据迁移率与相对分子质量的对数之间的关系,就可以计算出蛋白质的分子质量了。
通常以相对迁移率mR计算蛋白质的迁移率。电泳时,我们需要将一系列分子量已知的蛋白质分子量标准与待测样品在同一块胶上进行电泳。电泳结束后,量出每一条蛋白质条带的迁移距离和电泳指示剂溴酚蓝的迁移距离,也就是从加样孔到蛋白质条带或溴酚蓝条带中央的距离。根据蛋白质条带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离,计算出每一种蛋白质的相对迁移率。
用蛋白质分子量标准中的每一种蛋白质分子质量的对数为纵坐标,相对迁移率为横坐标,作图,得到一条标准曲线。根据待测蛋白质的迁移距离,计算出相对迁移率,就可以从标准曲线中查得蛋白质的分子质量了。
除了刚才我们提到的根据相对迁移率计算待测蛋白质分子质量的方法外,我们还可以通过比较待测蛋白质与蛋白质分子量标准的相对位置,估计待测蛋白质的近似分子质量。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
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-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
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--盐析操作注意事项
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--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试